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HIV-1 neutralisierende Antikörper als Werkzeuge für prophylaktische und therapeutische Impfansätze

Ringel, Max Oliver (2020):
HIV-1 neutralisierende Antikörper als Werkzeuge für prophylaktische und therapeutische Impfansätze.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00012816,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: HIV-1 neutralisierende Antikörper als Werkzeuge für prophylaktische und therapeutische Impfansätze
Language: German
Abstract:

Im Jahr 2019 lebten laut UNAIDS schätzungsweise rund 37 Millionen Menschen weltweit mit einer HIV-1 Infektion. Zudem infizieren sich jährlich etwa 1,8 Millionen Menschen mit dem humanpathogenen Erreger neu. Das Hauptangriffsziel von HIV-1 sind CD4+ T-Lymphozyten, die eine bedeutende Komponente der humanen adaptiven Immunantwort darstellen. In Folge einer HIV-1 Transmission nimmt die Anzahl an CD4-positiven T-Zellen, bedingt durch produktive Infektionen und eine anhaltende Hyperaktivierung des Immunsystems, kontinuierlich ab. Der massive Verlust an Immunzellen führt schließlich zu einem schweren Immundefekt, auch bekannt als AIDS, welcher in nahezu allen Fällen ohne antiretrovirale Therapie (ART) mit dem Tod des Betroffenen einhergeht. In der Regel werden HIV-positive Patienten heutzutage mit antiretroviralen Medikamenten therapiert, wodurch die HIV-Infektion unter Kontrolle bleibt. Trotz großer Erfolge in der Weiterentwicklung der ART gegen HIV-1, existiert bisher keine Heilung des Virus. Darüber hinaus ist eine lebenslange HIV-Therapie mit antiretroviralen Medikamenten häufig auch mit Nebenwirkungen und der Gefahr auftretender viraler Resistenzen gegenüber den ART-Medikamenten verbunden. Deshalb ist die Entwicklung einer protektiven Impfung, die Menschen vor einer Infektion mit HIV-1 schützen kann, das Hauptziel in der HIV-Forschung. Allerdings konnte dieses Bestreben bis heute nicht erreicht werden. Eine Ursache hierfür liegt unter anderem in der enormen genetischen Diversität und Flexibilität des HI-Virus. Neben der Impfstoffentwicklung liegt der Fokus auch auf der Erforschung alternativer HIV-Therapien, die weniger toxisch und daher besser verträglich sind. Interessante Kandidaten, die sowohl protektiv als auch therapeutisch besonders geeignet erscheinen, sind Antikörper mit breit neutralisierenden Eigenschaften (bnAbs), die einen Schutz gegen eine Vielzahl genetisch unterschiedlicher HIV-1 Subtypen liefern können. BnAbs sind in der Lage durch Bindung konservierter Bereiche des viralen Hüllproteins (Env), welche für den Viruseintritt in die Zelle von essentieller Bedeutung sind, deren Infektion zu verhindern. Darüber hinaus sind für nahezu alle bnAbs einige besondere Eigenschaften bekannt, wie eine hohe Anzahl somatischer Hypermutationen, außergewöhnlich lange heavy chain complementary determining regions 3 (HCDR3) und oftmals eine signifikante Poly- oder Autoreaktivität. Aufgrund des andauernden Selektionskreislaufes mit dem mutierenden Virus, werden solche Antikörper erst mehrere Jahre nach der initialen HIV-Infektion infolge von Affinitätsreifungsprozessen im Organismus evolviert. Trotz des detaillierten Wissensstands über bnAbs und deren Epitope innerhalb des HIV-Env, ist es bisher nicht gelungen, solche speziellen Antikörper mit Hilfe geeigneter Immunogene zu induzieren. Dennoch konnte für einige der potentesten bisher identifizierten bnAbs wie den 3BNC117, den 10-1074 oder den VRC01 in verschiedenen Studien mit nicht-humanen Primaten und auch Menschen das beträchtliche therapeutische Potential solcher Antikörper bereits nachgewiesen werden. Die Applikation einzelner Dosen führte sowohl in den SHIV-infizierten Affen als auch in den HIV-positiven Patienten zu einer rapiden Antikörpertiter-abhängigen Reduktion der Virusreplikation. Allerdings offenbarten die Studienergebnisse auch, dass für eine dauerhafte Kontrolle der Virusinfektion mehrere neutralisierende Antikörper notwendig sind, aufgrund der rapiden Entwicklung viraler Resistenzmutationen gegen einzelne bnAbs. Besonders wirkungsvoll erwiesen sich hierbei Antikörperkombinationen, die verschiedene Domänen des HIV-Hüllproteins erkennen. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Doktorarbeit neue HIV-1 neutralisierende Antikörper mittels zellbasierter Phagen-Display-Technologie selektioniert und deren Bindungs- und Neutralisationseigenschaften charakterisiert. Da das Antigen (HIV-Env) auf der viralen Oberfläche in nur etwa 10 bis 14 „Spikes“ vorliegt, erfolgte die Selektion HIV-spezifischer Antikörper unter Verwendung nativer membranassoziierter Hüllproteine, welche auf der Oberfläche transfizierter HeLa-Zellen präsentiert wurden. Diese Art der Antigenpräsentation, im Zusammenhang mit der Identifikation HIV-spezifischer bnAbs, ist bisher noch nicht publiziert worden und bietet daher möglicherweise eine neue Strategie zur Anreicherung neuartiger potenter bnAbs gegen HIV-1. Insgesamt wurden hierfür zwei Zelllinien mittels stabiler Transfektion generiert, die jeweils eine Variante des HIV-Env-Subtyps B bzw. -Subtyps C in der Plasmamembran exprimieren. Mit Hilfe der Durchfluss-zytometrie und Zell-Zell-Fusionsassays konnte sowohl die native Konformation als auch die Funktionalität der membranständigen Env-Moleküle nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde für beide HIV-Subtypen eine Anzahl von über 104 Env-Spikes pro HeLa-Zelle quantitativ ermittelt. Zudem wurden, ausgehend von einer Kohorte aus sieben rekrutierten long-term non-progressors (LTNPs), von vier LTNPs mit einer heterologen Plasma-Neutralisationsaktivität single-chain variable fragment (scFv)-Phagenbibliotheken aus dem Antikörpergenrepertoire generiert. LTNPs sind Patienten, die eine chronische HIV-1 Infektion durch verschiedene genetische und immunologische Wirtsfaktoren lang anhaltend ohne ART kontrollieren können. Experimentelle Studien haben bereits belegt, dass bnAbs in einer Gruppe von HIV-controllers mit niedriger Viruslast an der Kontrolle der HIV-1 Infektion maßgeblich beteiligt sind. Anhand der subtraktiven Selektion der Patienten-abgeleiteten Immunbibliotheken gegen das native virale Antigen, konnten fünf HIV-1 Env-spezifische Antikörperfragmente identifiziert werden. Drei der fünf selektionierten Antikörperklone waren zudem in der Lage, reformatiert an eine Fc-Domäne eines humanen IgG1, bis zu neun von insgesamt 16 getesteten unterschiedlichen Tier 1 bzw. Tier 2 Env-pseudotypisierten HI-Virusisolaten in vitro zu neutralisieren. Verglichen mit dem Neutralisationspotential der zurzeit potentesten bekannten bnAbs, fällt die Neutralisationsaktivität der identifizierten Antikörperklone zwar schwächer aus, allerdings zeigte der Klon scFv#1-Fc überraschenderweise neben seiner Neutralisations- auch eine ADCC-Aktivität. Somit liefern die Ergebnisse einen ersten Hinweis darauf, dass die beiden Antikörper-vermittelten Effektorfunktionen des scFv#1-Fc-Konstrukts möglicherweise in der Erkennung eines für bnAbs bisher unbekannten Bereiches in der viralen Hüllproteinstruktur begründet ist. Diese Annahme wird zusätzlich durch die Beobachtung untermauert, dass die ebenso identifizierten HIV-1 neutralisierenden Antikörperklone scFv#3-Fc und VHH#2-Fc, trotz der Kopplung an die gleiche Fc-Domäne, keine ADCC-Aktivität aufwiesen. In einem zweiten durchgeführten Projekt wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit das kürzlich identifizierte HIV-1 Epitop EC26-2A4 aufgrund der partiellen Überlagerung mit dem Kernepitop des polyreaktiven monoklonalen Antikörpers (mAb) 2F5 modifiziert. Das Epitop Ec26-2A4 ist innerhalb der hochkonservierten membrane-proximal external region (MPER) der gp41-Untereinheit des HIV-Hüllproteins lokalisiert und führt nachweislich zur Induktion nAbs in immunisierten Mäusen. Mit Hilfe von Peptidarrays konnte gezeigt werden, dass die Verkürzung des ursprünglich 29 Aminosäure (AS) langen Peptids auf acht AS (659ELLELDKW666) und die Substitution des Tryptophans an der Position 666 gegen ein Methionin mit dem Verlust der Epitoperkennung durch den mAb 2F5 einhergeht und darüber hinaus die Bindung EC26-2A4-spezifischer Antikörper nicht beeinträchtigt worden ist. Immunisierungsstudien mit der modifizierten Epitopvariante EC26-2A4ΔM offenbarten zudem die Induktion hoher Epitop-spezifischer Antikörpertiter in NMRI-Mäusen. Außerdem zeigten die Mausseren mit EC26-2A4ΔM-spezifischen Antikörpern in standardisierten TZM-bl-Reporterzell-Assays eine vergleichbare in vitro Neutralisationsaktivität, wie die mit dem unmutierten EC26-2A4 Peptid behandelten Tiere. Weiterhin wurde zusätzlich die Anwesenheit EC26-2A4ΔM-spezifischer Antikörper in zwei HIV-Patientenkohorten mittels ELISA evaluiert und mit klassischen klinischen Parametern korreliert: einer ART-positiven (~1000 HIV-Patienten) und einer ART-naiven Kohorte (71 LTNPs). Hierbei konnte für rund 9 % der Patienten, die unter Behandlung mit antiretroviralen Medikamenten stehen, das Vorhandensein EC26-2A4ΔM-spezifischer Antikörper nachgewiesen werden. In der ART-naiven Kohorte war der Anteil EC26-2A4ΔM-IgG positiver Patienten sogar um das 3-fache größer. Während für die therapierte Kohorte kein Unterschied bei den beiden bedeutenden HIV-1 Surrogatmarkern, der Viruslast und der CD4-Zellzahl, zwischen den Patienten mit und ohne solcher Epitop-spezifischer Antikörper beobachtet werden konnte, was vermutlich in der HIV-Therapie selbst begründet ist, zeigten Patienten der ART-naiven Kohorte mit EC26-2A4ΔM-spezifischen Antikörpern im Plasma reduzierte Mengen an viraler RNA und proviraler DNA. Interessanterweise wurde überdies eine nahezu doppelt so starke Reduktion der Viruslast in solchen Patienten ausgemacht, die neben EC26-2A4ΔM-spezifischen Antikörpern auch Immunglobuline gegen ein weiteres bekanntes MPER-Eptiop m3S aufwiesen. Zudem offenbarten die EC26-2A4ΔM-IgG, aufgereinigt aus dem Plasma von acht HIV-Patienten, ebenso eine heterologe Neutralisationsaktivität gegen HIV-1 Pseudoviren von vier unterschiedlichen Env-Subtypen. Des Weiteren konnte auch mittels ELISA für die Patienten-abgeleiteten Antikörper eine fehlende Kreuzreaktivität mit den Phospholipiden Cardiolipin und Phosphatidylserin ausgemacht werden, welche für den 2F5 Antikörper typisch sind. Die oben beschriebenen Ergebnisse lassen somit die Schlussfolgerung zu, dass eine Kombination beider gp41-Epitope möglicherweise einen geeigneten Ansatz zur Induktion therapeutisch wirksamer HIV-1 Antikörper darstellt.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
In 2019, UNAIDS estimated the number of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) infections worldwide to be about 37 millions and around 1.8 million new infections are added each year. HIV-1 primarily infects CD4+ T lymphocytes, which play an essential role in mediating human immune response. Transmission of HIV-1 results in continuous depletion of CD4+ T cells due to productive infections and persistent immune hyper-activation. The progressive loss of immune cells leads to a severe immunodeficiency, also known as AIDS (acquired immunodeficiency syndrome), which is mostly lethal in untreated persons. Nowadays, upon HIV infection, patients are normally treated with anti-retroviral therapy (ART), which can control the infection by suppressing HIV-1 replication to undetectable levels. Despite great success of ART, no cure exists so far and life-long ART is associated with side effects. Furthermore, a large number of HIV-infected persons is not aware of their infection, consequently are not treated by ART, but are high-risk transmitters. Therefore, the development of an effective vaccine is an important goal in order to prevent the transmission of HIV-1. However, efforts have not been successful until today. One reason is the vast genetic diversity of the pathogen and its capacity to circumvent the antiviral immune response of the host. Particularly interesting candidates for efficient vaccines and therapeutic treatments are antibodies with broadly neutralizing properties (bnAbs), which have been identified in a subgroup of HIV-1 positive persons and provide protection against multiple genetic HIV-1 subtypes in animal models. BnAbs are able to inhibit the entry of HIV-1 into host cells by interfering with receptor binding or membrane fusion. Moreover, it is known that many of these broadly and potently neutralizing HIV-1 antibodies contain special properties, such as exceptionally long heavy chain complementary determining region 3 (HCDR3) loops, a high frequency of somatic hypermutations, or significant poly- or auto-reactivity. Due to the ongoing race between the humoral host immune response and the mutating virus, broadly neutralizing antibodies occur only after several years in some infected individuals as consequence of affinity maturation processes. However, various studies in non-human primates and also in humans have shown the considerable therapeutic potential of such already identified bnAbs like the monoclonal antibodies (mAb) 3BNC117, 10-1074 and VRC01. The treatment of single doses of the bnAbs led to an antibody titer-dependent rapid decline in viral replication in SHIV-infected macaques as well as in HIV-positive patients. Nevertheless, the results revealed also that for durable control of HIV-1 infection more than one antibody is necessary due to rapid emerging of viral resistance against single bnAbs. Combinations of bnAbs targeting different domains within the HIV envelope protein proved to be particularly effective in this regard. Therefore, in the context of this thesis, new HIV-1 neutralizing antibodies were selected by cell based phage display-technology and analyzed for their binding and neutralization properties in vitro. Due to the fact that the envelope protein of HIV-1 is only present in about 10-14 Spikes at the surface of the virus particle, the selection of HIV-specific antibodies was performed using native membrane-associated HIV Env complexes displayed on the surface of infected HeLa cells. This way of antigen presentation in connection with the identification of HIV-specific bnAbs has not been published to date and provides possibly a new strategy to enrich novel potent bnAbs against HIV-1. Two cell lines were generated by stable transfection each expressing one variant of HIV-1 Env of subtype B and C, respectively, in the plasma membrane. The native conformation as well the functionality of the membrane-bound Env molecules could be shown by flow cytometry and cell-cell fusion assays. In addition, more than 104 Env Spikes per HeLa cell were quantitatively identified for both HIV subtypes. Starting from a cohort of seven recruited HIV-1 infected long-term non-progressors (LTNPs) single-chain variable fragment (scFv)-libraries were constructed from the antibody gene repertoire of four patients with heterologous plasma neutralization activity. LTNPs are individuals chronically infected by HIV, who can control the viremia without anti-retroviral therapy by different genetic and immune host or viral factors. Experimental studies have shown the significant involvement of bnAbs in the control of HIV infection in a group of LTNPs with low viral loads. By means of subtractive selection, five HIV-1 Env-specific antibody fragments were identified from the patient-derived immune libraries against the natively folded HIV-1 envelope antigens. Furthermore, three of the selected five antibody clones were able to neutralize nine out of 16 tested different Tier 1 and Tier 2 Env-pseudotyped HIV isolates in vitro, when reformatted into a Fc region of a humane IgG1. Compared to the neutralization potential of the most potent bnAbs presently known, the neutralization activity of the identified antibody clones is weaker. However, interestingly, clone scFv#1-Fc showed antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) in addition to neutralization. Therefore, these results could give a first hint that both antibody-mediated effector functions of clone scFv#1-Fc are may be justified by recognition of a region within the Env structure which is unknown for HIV-1 bnAbs to date. Moreover, this assumption is substantiated by the findings that two further identified HIV-1 neutralizing antibody clones (scFv#3-Fc and VHH#2-Fc) coupeld to the same Fc fragment, show no ADCC activity. In a second project performed within this thesis, the recently identified new HIV-1 epitope EC26-2A4 within the highly conserved membrane-proximal external region (MPER) of the HIV-1 transmembrane protein gp41, which induced neutralizing antibodies upon immunization in mice, was optimized due to a partial overlap with the core epitope of the HIV-neutralizing, but poly-reactive monoclonal antibody (mAb) 2F5. With the help of peptide arrays it was shown that the truncation of the wild type epitope from original 29 amino acids (aa) to 8 aa (659ELLELDKW666) and the substitution of tryptophan at position 666 against a methionine results in the loss of mAb 2F5 recognition without disturbance of EC26-2A4-IgG binding. Prime boost immunization studies with the optimized peptide variant EC26-2A4ΔM in NMRI mice reveal the induction of high epitope-specific antibody titers. Furthermore, mice immune sera positive for EC26-2A4ΔM-specific antibodies showed neutralization activity comparable to animals treated with the wild type epitope measured by standardized luciferase based reporter assays in TZM-bl cells in vitro. In addition, the presence of antibodies against the MPER motif were evaluated in the plasma of two HIV patient cohorts (one ART-treated (~1000 HIV patients) and one ART-naïve cohort (71 HIV patients)) by ELISA and correlated subsequently with classical clinical parameters. For approximately 9 % of ART-positive patients EC26-2A4ΔM-specific antibodies could be detected in the plasma samples, whereas the fraction of EC26-2A4ΔM-positive patients in the ART-naïve cohort was about 3-fold higher. In the patient cohort under treatment with antiretroviral drugs no correlation with determining HIV surrogate markers (e.g. viral load and CD4 count) were observed, probably due to the antiviral therapy. In contrast, the presence of EC26-2A4ΔM-specific antibodies in ART-naïve patients correlated with reduced levels in viral RNA and proviral DNA. Surprisingly, individuals of the untreated cohort with antibodies against the EC26-2A4ΔM motif and a second gp41-epitope m3S showed almost twice as much reduction in viral load. Furthermore, antibodies affinity purified with the EC26-2A4ΔM epitope from eight patient sera showed also heterologous neutralization activity against HIV-1 pseudoviruses of four different Env subtypes. Even more, no cross-reactivity with the phospholipids cardiolipin and phosphatidylserine were observed for the patient-derived antibodies. Therefore, based on the above results, it can be concluded that a combination of both MPER epitopes EC26-2A4ΔM and m3S may represent a suitable strategy to induce HIV-1 antibodies with therapeutic efficacy.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 09 Sep 2020 14:44
Last Modified: 09 Sep 2020 14:45
DOI: 10.25534/tuprints-00012816
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-128168
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Süß, Prof. Dr. Beatrix
Refereed: 4 May 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/12816
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