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Entwicklung eines neuartigen Ansatzes zur therapeutischen Vakzinierung chronischer HBV-Infektionen

Zahn, Tobias (2020):
Entwicklung eines neuartigen Ansatzes zur therapeutischen Vakzinierung chronischer HBV-Infektionen.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00011886,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Entwicklung eines neuartigen Ansatzes zur therapeutischen Vakzinierung chronischer HBV-Infektionen
Language: German
Abstract:

Aktuell leiden weltweit etwa 257 Millionen Menschen an einer chronischen Hepatitis-B-Virus- Infektion. In den meisten Fällen ist eine ungenügende T-Zellantwort für die Entwicklung einer Chronizität verantwortlich. Um eine ausreichende zelluläre, zytotoxische T-Zellantwort hervorzurufen und die Produktion neutralisierender Antikörper zu induzieren, wurde eine neuartige Impfstoffplattform etabliert, welche auf modifizierten, zellpermeablen Capsiden des Hepatitis-B-Virus (HBV) basiert. Die Permeabilität wurde durch die Fusion des Membran-permeablen Peptids Translocation motif (TLM) an die HBV Core-Protein- Monomere erreicht, aus welchen sich das Capsid assembliert (TLMcapside). Durch die Insertion eines Strep-tagIII in die Spike-tip Domäne, welche sich auf der Oberfläche der Capside befindet, können Antigene, welche mit Streptavidin fusioniert wurden, flexibel auf die Trägercapside geladen werden. In dieser Arbeit wurden die Domänen PreS1 und PreS2 der HBV-Oberflächenproteine mit monomerem Streptavidin fusioniert (mSA_preS1/2), um sie als Antigene auf die Oberfläche der Capside zu laden. Antigene und Capside wurden in bakteriellen Expressionssystemen produziert und mittels Affinitätschromatografie gereinigt. Die Bindung zwischen Antigen und Capsid wurde mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie und Dichtegradientenzentrifugation charakterisiert. Unter Verwendung von konfokaler Laser- scanning-Mikroskopie und in-vivo-Imaging konnte die Membranpermeabilität der mSA_preS1/2-beladenen TLMcapside und deren Ausbreitung durch Zellen, Hautschichten, Organe und den gesamten Organismus festgestellt werden. Die Immunisierung von Mäusen mit den zellpermeablen, beladenen Capsiden führte einerseits zu einer starken humoralen Immunantwort mit HBV-spezifischen neutralisierenden Antikörpern und andererseits zu einer spezifischen T-Zellantwort, welche in der Eliminierung von HBV-positiven Zellen resultierte. Die Membranpermeabilität dieser Trägercapside ermöglicht zudem eine Nadel-freie, nichtinvasive Verabreichung von Antigen-beladenen Capsiden. Dies wurde durch die Immunisierung mithilfe von Pflastern über die transdermale Route sowie über die oral- mukosale Aufnahme über die Mundschleimhäute beobachtet. Bei erfolgreicher Immunisierung konnte somit eine HBV-spezifische T-Zell- und B-Zellantwort induziert werden. Die erhobenen Daten weisen darauf hin, dass die permeablen mSA_preS1/2- beladenen TLMcapside die Kapazität besitzen, eine starke, zelluläre sowie eine neutralisierende, humorale Immunantwort auszulösen, weshalb sie als therapeutisches Vakzin gegen chronische HBV-Infektionen eingesetzt werden könnten. Zusätzlich ermöglicht die Zellpermeabilität dieser Impfstoffplattform den Antigentransfer über mehrere Zellschichten und erlaubt somit alternative, nichtinvasive Routen wie oral-mukosale und transdermale Immunisierung.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
There are approximately 257 million people suffering from chronic hepatitis B virus infection worldwide. In most cases, an insufficient T cell response is causative for developing chronicity. To generate a robust CTL response and induce expression of neutralizing antibodies, a novel vaccine platform was established, based on modified, cell permeable hepatitis B virus (HBV) capsids. Permeability is achieved by fusion of the membrane- permeable translocation motif (TLM) to HBV core proteins, which assemble to capsids (TLMcapsids). By insertion of a Strep-tagIII into the spike tip domain, localized on the capsids surface, streptavidin-fused antigens can be loaded on to these permeable carrier capsids. In this study, HBV surface protein domains PreS1 and PreS2 were fused with monomeric streptavidin (mSA_preS1/2) to generate an antigen that can be coupled onto the capsids. Antigens and capsids were produced in a bacterial expression system and purified via affinity chromatography. Binding efficiency between both components was determined with surface plasmon resonance spectroscopy, transmission electron microscopy and density gradient centrifugation. Using confocal laser scanning microscopy and in vivo imaging, membrane permeability of mSA_preS1/2-loaded TLMcapsids and their spread through cells, skin tissue, organs and whole organisms was characterized. Immunization of mice with cell-permeable, loaded capsids led to induction of a strong humoral immune response with HBV-specific neutralizing antibodies and to a specific T cell response, resulting in the elimination of HBV-positive target cells. Membrane permeability also enables needle-free and noninvasive administration of antigen-loaded capsids. This was proven by vaccination via transdermal route using patches and via oral-mucosal up-take through mucosal mouth tissue. After successful immunization, an HBV-specific T cell and B cell response could be induced. Data of this study suggest that permeable mSA_preS1/2-loaded TLMcapsids are able to induce a robust cellular as well as a neutralizing humoral immune response. The antigen-loaded TLMcapsids could therefore be utilized as a therapeutic vaccine against chronic HBV infections. Additionally, cell permeability of this vaccine platform enables antigen transfer through several cell layers and could therefore permit alternative, noninvasive routes like oral-mucosal and transdermal immunization.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 10 Department of Biology > Synthetic Genetic Circuits
Date Deposited: 01 Jul 2020 08:08
Last Modified: 13 Jul 2020 06:08
DOI: 10.25534/tuprints-00011886
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-118864
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Hildt, Prof. Dr. Eberhard
Refereed: 17 June 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11886
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