Trotz massiven medizinischen Fortschritts und ausgiebigen Untersuchungen in der Krebsforschung repräsentieren maligne Tumore immer noch eines der größten globalen Gesundheitsprobleme. Daher liegt das Auslösen der Apoptose von Tumorzellen seit Jahren im Fokus der Forschung. Neben den klassischen Ansätzen, wie Operationen, Strahlen- und Radiotherapie, sowie Chemotherapie wurden neue Methoden zur Behandlung von Krebs entwickelt. Hierzu zählt das Konzept der zielgerichteten Therapie, für das monoklonale Antikörper ein prominentes Beispiel darstellen. Eine zusätzliche Komponente dieses Ansatzes stellen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) dar, die dem von Paul Ehrlich geprägten Konzept der „Zauberkugel“ entsprechen. Diese Klasse von Verbindungen zielen auf den ortspezifischen Transport und die Abgabe eines Zytostatikums an Zielzellen ab, die tumorspezifische Antigene exprimieren. Diese Konstrukte kombinieren die Bindungseigenschaften eines Antikörpers mit der Toxizität eines Zytostatikums und wurden in zahlreichen Ansätzen für die Krebstherapie eingesetzt. So wurden bis heute sechs ADCs kommerziell vermarktet und über 60 werden aktuell in klinischen Studien untersucht. Trotzdem besteht weiterhin ein gewisses Verbesserungspotential dieser potenten Verbindungen hinsichtlich ihrer Toxizität, Effizienz und pharmakokinetischen Eigenschaften.

Die erste Untersuchung im Rahmen der hier vorliegenden, kumulativen Dissertation fokussierte sich auf die Generierung von ADCs, die ein hohes Wirkstoff-zu-Antikörper Verhältnis (DAR) aufweisen und deren Hydrophilie durch Anfügen von Zytotoxinen nicht beeinträchtigt wird. Da lediglich ein geringer Anteil des verabreichten ADCs tatsächlich die adressierten Zielzellen erreicht, sind entweder hochwirksame oder eine hohe Anzahl weniger potenter Zytotoxine unerlässlich, um die gewünschte Effektivität zu erzielen. In Anbetracht des hydrophoben Charakters der am häufigsten eingesetzten Zytotoxine weisen diese Konjugate jedoch häufig eine niedrige Hydrophilie auf, welche abhängig von der adressierten Konjugationsstelle, der Anzahl und dem Charakter der angewendeten Toxineinheiten ist. Folglich hat die Hydrophobizität der konjugierten Zytostatika einen großen Einfluss auf die Stabilität sowie die pharmakokinetischen Eigenschaften und bestimmt somit die Effizienz des ADCs. So wurde beispielsweise von Problemen bezüglich Aggregation, Erkennung durch multidrug resistance (MDR) Rezeptoren und erhöhter Clearance berichtet. In dieser Arbeit sollten diese Probleme durch das Design einer neuen Klasse von Hybrid-ADCs gelöst werden, die die Hydrophobizität der im Kontext von ADCs weithin genutzten Zytostatika mindern oder sogar gänzlich kompensieren kann und zusätzlich die Möglichkeit eröffnet, eine gewünschte Menge dieser potenten Toxine pro Antikörper zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich sollte eine zukünftige Beladung mit weniger wirksamen und folglich weniger schädlichen Toxinen ermöglicht werden, bei denen die reduzierte Toxizität durch eine erhöhte Kopienzahl kompensiert wird. Dextran, ein von der FDA zugelassenes Polysaccharid, das aus α-1,6-verknüpften Oligoglukoseeinheiten besteht, wurde in dieser Arbeit als modulares, multivalenzgenerierendes Grundgerüst für die ortsspezifische Konjugation an Antikörper und für die Beladung mit einer gewünschten Anzahl an Zytostatika verwendet. Für die Konjugation dieses Glucans an Proteine wurde berichtet, dass sie die Halbwertszeit, die thermische Stabilität sowie die pharmakokinetischen Eigenschaften dieser verbessert und deren Immunogenität verringert. Weiterhin bietet sich die Möglichkeit, chemische Modifikationen an unterschiedlichen Stellen dieses Zuckermoleküls, zur Einführung orthogonal adressierbarer Gruppen durchzuführen. So kann sowohl eine gewünschte Anzahl an Zytostatika an den Hydroxygruppen der Glukose-Wiederholungseinheiten als auch ein Erkennungsmotiv für die enzymatische Konjugation an ein Protein an das orthogonal adressierbare Aldehyd am reduzierenden Ende angebracht werden. In dieser Arbeit wurde zudem eine Synthesestrategie entwickelt, die es ermöglicht, Dextran, beladen mit einer gewünschten Anzahl orthogonal adressierbarer chemischer Gruppen zur Toxinkonjugation, mittels Enzymkatalyse ortsspezifisch an einen Antikörper zu konjugieren und anschließend mit Toxinen auszustatten. Diese Hybridverbindung ebnete den Weg zur Generierung neuer, vielversprechender hoch hydrophiler ADCs mit hohem Wirkstoff-zu-Antikörper Verhältnis. Synthetisch wurde hierfür eine reduktive Aminierung mit einem geschützten Diamin am reduzierenden Ende mit einer ortsspezifischen Carboxyethylierung an der C2-Position der Glukose-Wiederholungseinheiten verbunden, woraus ein Dextran mit zwei unterschiedlich adressierbaren reaktiven Gruppen resultierte. Dabei konnte eine gewünschte Anzahl der Carboxygruppen an den Glukose-Wiederholungseinheiten eingestellt werden. Anschließend wurden amintragende Azidlinker unter Bildung von Amidbindungen kovalent an den eingebauten Carboxygruppen der Glukose-Wiederholungseinheiten eingeführt, woraus ein Dextranrückgrat mit multiplen Azid-Funktionalitäten resultierte. Die Demaskierung des geschützten Amins am reduktiven Ende ergab schließlich dual adressierbare Polysaccharidgerüste mit multiplen „click“-baren Gruppen zur Konjugation der Zytostatika und einem primären Amin, mittels dessen eine enzymkatalysierte Konjugation an den Antikörper realisiert werden konnte. Trastuzumab, welcher genetisch mit einer Transglutaminase-Erkennungssequenz versehen wurde, diente hierbei als Modellantikörper. Die Konjugation des azidtragenden Dextrangerüsts an Trastuzumab unter Katalyse von mikrobieller Transglutaminase und die darauffolgende Konjugation eines potenten, sehr hydrophoben Zytoskelettinhibitors (Monomethylauristatin E (MMAE)), bildete ein neues Hybridkonstrukt. So wurde Dextran in dieser Arbeit zum ersten Mal ortsspezifisch an einen Antikörper gekoppelt und sukzessive mit einer gewünschten Anzahl an Zytostatika durch spannungskatalysierte Azid‐Alkin‐Cycloaddition (SPAAC) beladen. Diese neuen, als Dextramabs bezeichneten Hybridkonstrukte erwiesen sich nicht nur als gut löslich in wässrigen Puffern, sondern auch als mindestens ebenso hydrophil wie der nicht modifizierte Trastuzumab, selbst wenn das Polysaccharid mit elf hydrophoben MMAEs beladen wurde. Weiterhin zeigten die generierten Konstrukte unveränderte Bindungseigenschaften und keinen Stabilitätsverlust (Trastuzumab: KD = 4.9 nM, Dextramab (DAR 8): KD = 5.9 nM). In Zellviabilitätstests zeigten die entwickelten Dextramabs potente, subnanomolare mittlere inhibitorische Konzentration (IC50 = 100 pM) auf HER2-positiven SK-BR-3 Brustkrebszellen in vitro, wohingegen keine Toxizität für HER2-negative Kontrollzellen gefunden wurde. Dextramabs stellen eine neue Strategie für die Generierung ortsspezifisch konjugierter hoch-hydrophiler ADCs mit einem hohen DAR dar. Tierstudien werden zeigen, ob diese neue Klasse von ADCs ein vielversprechendes Konzept zur Generierung von ADCs mit hoher Wirksamkeit, geringer Immunogenität und erhöhter in vivo-Halbwertszeit repräsentiert.

In der zweiten Untersuchung wurde die Modularität von Dextran als Träger für Apoptose-induzierende Moleküle, die sowohl intrazelluläre als auch Ziele auf der Zelloberfläche adressieren, untersucht. Im Zuge dessen wurde, im Gegensatz zum ersten Ansatz, Dextran als eine Plattform zur Multimerisierung von krebsspezifischen Liganden untersucht. Der extrazellulär exprimierte Death Rezeptor 5 (DR5) wurde hierfür als Modellziel gewählt, welcher durch Aggregation beziehungsweise Multimerisierung aktiviert wird und eine Apoptose-induzierende Signal-Kaskade auslöst (death-inducing singal cascade, DISC). In dieser Arbeit wurde Dextran als Grundgerüst mit mehreren peptidischen Liganden (death receptor 5-targeting peptide, DR5TP) von DR5 bestückt und im Hinblick auf seine Apoptose-induzierende Wirkung untersucht. Hierbei sollte, im Gegensatz zu der ersten Untersuchung, der Zelltod durch Multimerisierung von Rezeptoren auf der Zelloberfläche induziert werden und nicht durch rezeptorvermittelte, endosomatische Aufnahme eines an den Antikörper gebundenen Zytostatikums. Hierfür wurde Dextran mit 11 respektive 13.4 DR5TP-Liganden beladen und auf seine Apoptose-induzierende Wirkung untersucht. Die resultierenden multivalenten Dextrangerüste zeigten mit zweistellig nanomolaren EC50-Werten (halbmaximalen effektiven Konzentrationen) auf DR5-positiven COLO205-Kolonzellen und Jurkat T-Lymphozyten eine potente Apoptose-induzierende Wirkung in vitro. Eine anschließende ortsspezifische Konjugation an Glutamin 295 eines aglykosylierten kristallisierbaren Fragments (Fragment, crystallizable, Fc) mittels mikrobieller Transglutaminase resultierte in Protein-Polysaccharid-Konjugaten, die eine selektive DR5-Bindung in durchflusszytometrischer Analyse zeigten und die im Vergleich zu den nicht an ein Protein konjugierten DR5TP-Dextranen sogar niedrigere EC50-Werte aufwiesen (EC50 = 1.9 - 6.7 nM). Interessanterweise wurde die Bindung dieser Konjugate nicht durch den Antikörper, sondern durch das mit Liganden bestückte Dextran hervorgerufen. Dies ermöglicht die zukünftige Verwendung einer zweiten Bindungseinheit im Hinblick auf bispezifisches Targeting, beispielsweise durch die Konjugation an einen Vollängen Antikörper, wodurch eventuell eine höhere Sicherheit und Effizienz realisiert werden könnte. Weiterhin ermöglichten die hergestellten Konjugate, sowohl solitär als auch gebunden an das Fc-Fragment, durch die erhöhte Flexibilität des Dextranrückgrats die beschriebene distinkte räumliche Anordnung als unumgängliche Voraussetzung für effizientes Induzieren von Apoptose zu kompensieren. Dieser Ansatz untermauert die Modularität von Dextran als Träger für unterschiedlichste Beladungen, die verschiedene Zielstrukturen zur gezielten Auslösung von Apoptose von Tumorzellen adressieren. Zukünftig könnte dieser Ansatz einen Lösungsvorschlag für die berichtete Off-target Toxizität von multivalenten hochaffinen proteinischen Bindern, wie TAS266, darstellen, da hierin eine höhere Anzahl an Bindern mit niedriger Affinität verwendet wird. Dies könnte zu einer geringeren Retention auf gesunden Zellen mit geringerer DR5 Expressionsdichte und somit einer höheren Verträglichkeit in vivo führen, die zusätzlich durch Einführung von Bispezifität erhöht werden könnte.

Der dritte Teil dieser Arbeit sollte einen detaillierten Überblick über die enzymatische Generierung von ADCs mittels Transglutaminase geben. Trotz zahlreicher Publikation von Reviews zur Generierung von ADCs fehlt bis heute ein Überblick, der die Anwendung von Transglutaminase für diese Therapeutika detailliert beschreibt. Aus diesem Grund gibt der verfasste Review einen Überblick über die an dieser Thematik forschenden Arbeitsgruppen und Firmen, als auch eine gründliche Übersicht der eingesetzten Methoden, der adressierten Konjugationsstellen oder -motive, Linkern und verwendeten Zytostatika. Dieser Review beschreibt und diskutiert zukunftsweisende Syntheserouten und techniken, die jüngsten Fortschritte sowie verbleibende Einschränkungen der mTG-unterstützten Generierung von ADCs. Zusätzlich wurde eine weitere Studie durchgeführt, die die Verwendung von Dextran als multivalentes Grundgerüst untermauert. Hierfür wurde eine vorläufige Studie zur Validierung von Dextran als Träger für multiple chelatierende Komplexbildner, die Ionen für die Radiobildgebung oder -therapie komplexieren können, durchgeführt. Hierfür wurde Dextran mit einer gewünschten Anzahl an 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) beladen. In einer photometrischen Analyse von komplexierten Cu2+-Ionen konnte gezeigt werden, dass die resultierenden DOTA-Dextrankonjugate 3.2 respektive 5.3 Metallionen pro Polysaccharidgerüst tragen. Zurzeit werden die hergestellten DOTA-Dextrankonjugate in Biodistributionsstudien in Mäusen untersucht. Diese Konzeptstudien werden zeigen, ob diese neuen Konstrukte für in vivo Anwendungen geeignet sind und ob eine Konjugation an derzeit verwendete spezielle Bindungsproteine (Affibodies), welche in radioaktiv markierter Form Probleme mit der Hydrophobizität und daher mit Solubilität, Aggregation und Präzipitation haben, vorteilhaft ist. Dieser Ansatz bestärkt die Vermutung, dass Dextran ein vielversprechendes Gerüst für die mehrwertige Befestigung und Anpassung verschiedener Liganden darstellt.