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Relevanz der Ubiquitinierung für die Resektionsregulation in G1-Phase-Zellen an schwerioneninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen

Barent, Carina (2020):
Relevanz der Ubiquitinierung für die Resektionsregulation in G1-Phase-Zellen an schwerioneninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen.
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt, DOI: 10.25534/tuprints-00011439,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Relevanz der Ubiquitinierung für die Resektionsregulation in G1-Phase-Zellen an schwerioneninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen
Language: German
Abstract:

Infolge endogener und exogener Einflüsse kommt es jeden Tag zu Schäden an der DNA, dem Träger der gesamten genetischen Information. Der DNA-Doppelstrangbruch (DSB) gilt hierbei als schwerwiegendster DNA-Schaden, infolgedessen von der Zelle Signalkaskaden eingeleitet werden, um die entstandenen Schäden über verschiedene Reparaturmechanismen zu beheben. Ein wichtiger Mechanismus zur Regulation der DNA-Schadensantwort (DNA damage response = DDR) ist die posttranslationale Modifikation (PTM) von Proteinen durch Ubiquitinierung. Neben den beiden Haupt-DSB-Reparaturmechanismen, der spezifisch für S/G2 resektionsabhängigen Homologen Rekombination (HR) und der stetig verfügbaren klassischen Variante der Nicht-homologen Endverknüpfung (classical non-homologous end joining = c-NHEJ), besitzt die Zelle zudem die Möglichkeit DSBs während des gesamten Zellzyklus resektionsabhängig über alternative Wege der Endverknüpfung (alt-EJ) oder den resektionsabhängigen Weg des c-NHEJ zu reparieren. Während sich die HR einer homologen Matrize als Vorlage zur Reparatur bedient und daher fehlerfrei vonstattengeht, kommt es sowohl beim klassischen NHEJ (c-NHEJ) als auch bei alternativen Wegen der Endverknüpfung (alt-EJ) häufig zu kleineren Insertionen oder Deletionen, wodurch die Wahrscheinlichkeit für chromosomale Aberrationen deutlich erhöht ist. Die Wahl des Reparaturwegs wird durch den Schritt der DNA-End-Prozessierung durch Resektion entscheidend beeiflusst. Veröffentlichungen zeigten, dass mit steigendem linearen Energietransfer (linear energy transfer = LET) und damit steigender DNA-Schadenskomplexität die DSB-Reparatur nicht nur in S/G2, sondern auch in G1 vermehrt resektionsabhängig verläuft. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Regulation der DNA-End-Resektion in G1-Phase-Zellen nach Induktion komplexer DSBs genauer zu untersuchen. Da veröffentlichte Studien belegten, dass für die DDR und auch Resektion essentielle Proteine in der S/G2-Phase durch Ubiquitinierung reguliert werden, wurde bei den durchgeführten Untersuchungen ein besonderes Augenmerk auf die posttranslationale Modifikation durch Ubiquitinierung als möglichen Resektionsregulator gelegt. Die Relevanz dieser Form der Modifikation für die DDR nach Induktion von DNA-Schäden durch Bestrahlung bestätigten Ubiquitin-Pulldown-Analysen, in denen deutlich zu erkennen war, dass nach Bestrahlung mit Röntgen und vor allem hoch-LET Eisenionenbestrahlung Proteine vermehrt ubiquitiniert wurden. Für S/G2 war bekannt, dass die E3 Ubiquitin-Ligase RNF138 Resektion fördert, indem einerseits der Resektionsantagonist Ku80 infolge dessen Ubiquitinierung durch RNF138 vom Schaden entfernt und exzessivere Resektion ermöglicht wurde. Andererseits wurde beschrieben, dass die Rekrutierung des Resektionsfaktor CtIP durch dessen Ubiquitinierung ebenfalls durch RNF138 erleichtert wird. Eine siRNA-basierte Herunterregulation sowie der komplette Knockout der Ubiquitin-Ligase RNF138 demonstrierte die Wichtigkeit von RNF138 für die Resektion in beiden Zellzyklusphasen, G1 und S/G2, da die Anzahl an Resektions- (RPA-) positiven Zellen nach Induktion komplexer Schäden in RNF138-depletierten Zellen deutlich verringert war. Untersuchungen zum RNF138-Zielprotein Ku80 offenbarten, dass der Resektionsantagonist Ku80 nach Induktion komplexer DSBs ungeachtet der Verfügbarkeit von RNF138 und der Zellzyklusphase von der Schadensstelle entfernt wird. Resektions- und Ubiquitin-Pulldown-Analysen in RNF8-depletierten Zellen deuteten in diesem Zusammenhang vielmehr auf eine Beteiligung von RNF8 bei der Resektionsregulation in G1 durch Ubiquitinierung von Ku80 hin. Studien zum RNF138-Target CtIP zeigten nach Induktion komplexer Schäden durch Ionen- sowie Laserbestrahlung eine deutlich verringerte Rekrutierung des Resektionsfaktors an DSBs nicht nur in RNF138-depeltierten S/G2-, sondern auch in G1-Phase-Zellen. Zudem war mittels Ubiquitin-Pulldown-Analysen in RNF138-KO-Zellen kein CtIP in seiner ubiquitinieten Form nachzuweisen. Dies belegte, dass CtIP auch in G1-Phase-Zellen ein Zielprotein von RNF138 ist. Somit spielt die posttranslationale Modifikation durch Ubiquitinierung auch bei der Regulation der Resektion in G1-Zellen eine wichtige Rolle. Abschließende DSB-Reparatur- sowie Zellüberlebensstudien belegten eine Relevanz der E3 Ubiquitin-Ligase RNF138 für die DSB-Reparatur und das klonogene Zellüberleben nach niedrig-energetischer hoch-LET Kohlenstoffionenbestrahlung (Primärenergie 11,4 MeV/u; LET: 168 keV/µm). Der Vergleich von DSB-Reparaturanalysen durch Bestrahlung mit anderen Strahlenqualitäten induzierter DSBs stellte eine Bedeutung von RNF138 für die DSB-Reparatur sowie das klonogene Zellüberleben mit steigender Komplexität der induzierten Schäden heraus. Zusammenfassend kann demnach festgehalten werden, dass die Ubiquitin-Ligase RNF138 für die Ubiquitinierung des Resektionsfaktors CtIP auch in G1 nach Induktion komplexer Schäden wichtig ist, dass sich Auswirkungen einer RNF138-Defizienz auf die DSB-Reparatur und das klonogene Zellüberleben jedoch erst nach Induktion sehr komplexer Schäden wie durch Kohlenstoffionenbestrahlung (Primärenergie: 11,4 MeV/u; LET: 168 keV/µm) erkennen lassen. Wissend, dass ioneninduzierte, komplexe DSBs unabhängig von der Zellzyklusphase vermehrt resektionsabhängig repariert werden und die Ubiquitin-Ligase RNF138 in beiden Zellzyklusphasen für die DNA-End-Resektion in seiner Funktion CtIP zu ubiquitinieren von entscheidender Bedeutung ist, könnte die Inhibition der Ubiquitin-Ligase ein aussichtsreicher Ansatzpunkt für die Radiotumortherpaie mit Schwerionen darstellen. Während durch Bestrahlung mit Schwerionen im Bereich des Normalgewebes wenig Dosis freigesetzt und Schäden geringer Komplexität hervorgerufen werden, wird der Hauptteil der Dosis im sog. Bragg-Peak im Zielgewebe, dem Tumor, appliziert. Folglich entstehen im Tumorgewebe komplexe Schäden an der DNA, die im Gegensatz zu den weniger komplexen Schäden im umliegenden Normalgewebe resektionsabhängig über CtIP repariert werden müssen, was wiederum die Verfügbarkeit der Ubiquitin-Ligase RNF138 erfordert. Die RNF138-Inhibition könnte somit gezielt das Überleben der Tumorzellen negativ beeinflussen und als Inhibitor des Ubiquitin-Proteasom-Systems in der Tumortherapie in Kombination mit Schwerionenbestrahlung Anwendung finden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Every day the carrier of all the genetic information, the DNA, gets damaged by exogenous and endogenous factors. The most severe lesions are DNA double-strand breaks (DSBs). In order to repair these damages by different repair mechanisms, signal cascades are activated. An important regulator of the DNA damage response (DDR) is the posttranslational modification (PTM) of proteins by ubiquitination. Besides the two main DSB repair mechanisms, the resection-dependent homologous recombination (HR) in S/G2 and the classical non-homologous end joining (c-NHEJ) that is available throughout the entire cell cycle, cells have the opportunity to repair DSBs resection dependent in all cell-cycle phases via alternative end-joining pathways or the resection dependent c-NHEJ. HR depends on a homologous template to repair the damage and is hence is error-free. Repair by c-NHEJ or alt-EJ pathways on the other hand frequently leads to small insertions or deletions that increases the probability of chromosomal aberrations. The repair pathway choice is decisively influenced by the DNA-end processing by resection. Publications revealed, that upon induction of complex DSBs and irradiation with increasing linear energy transfer (LET) DSBs increasingly become subject to resection in S/G2 as well as in G1-phase. Therefore, the resection regulation in G1 upon induction of complex lesions was studied in more detail in the presented work. As earlier studies showed that the posttranslational modification by ubiquitination plays a critical role in DDR and break-end resection in S/G2 cells, the focus of this work on resection regulation in G1 cells was on ubiquitination. The relevance of the protein modification by ubiquitination for the DDR was verified by an ubiquitin-Pulldown analysis upon induction of DNA lesions by irradiation with X-rays or iron ions that showed an increased fraction of ubiquitinated proteins after irradiation, especially with high-LET iron ions. It is known that the E3 ubiquitin ligase RNF138 stimulates resection in S/G2 by ubiquitination and removal of the resection antagonist Ku80 on the one hand. On the other hand, RNF138 facilitates the recruitment of the resection factor CtIP by ubiquitination. SiRNA-mediated Knockdown and RNF138 Knockout analyses revealed the importance of RNF138 for the DNA-end resection in both cell cycle phases, G1 and G2, as the fraction of resection (RPA-) positive cells was clearly reduced in RNF138-depleted G1 cells upon induction of complex DSBs. Studies on Ku80 indicated that Ku80 gets removed from break sites upon induction of complex lesions, but RNF138 did not seem to be the only factor to ubiquitinate Ku80 as the resection antagonist was removed even in RNF138-KO cells. In fact a participation of RNF8 was suggested by studies on resection and ubiquitin-Pulldown analysis in RNF8-depeleted cells. Studies on the RNF138 target CtIP showed a reduced fraction of CtIP-positive cells upon carbon-ion irradiation in RNF138-depleted G1 cells. Moreover ubiquitin-Pulldown analysis in RNF138-KO cells indicated a modification by ubiquitination of CtIP by RNF138. Hence, resection is regulated by ubiquitination of the resection factor CtIP by RNF138 in G1-phase cells as well. DSB repair as well as the clonogenic cell survival studies upon high-LET carbon-ion irradiation of lower energies (primary energy: 11.4 MeV/u; LET 186 keV/µm) pointed out that the DSB repair and the clonogenic cell survival of RNF138-deficient cells was impaired. In comparison, upon irradiation with other radiation qualities like X-rays or high energetic iron-ions no effect could be observed. Consequently, RNF138 seems to be important upon induction of DSBs of high complexity. Taken together, the E3 ubiquitin ligase RNF138 was revealed to be important for the ubiquitination and the following recruitment of the resection factor CtIP to DSBs upon induction of complex lesions even in G1-phase cells. An impact on cell survival or DSB repair after irradiation was only observed upon induction of DSBs of high complexity. Since repair of ion-induced complex DSBs runs increasingly resection-dependent and the ubiquitin ligase RNF138 is important for the ubiquitination and recruitment of the resection factor CtIP in G1- and G2-phase, this inhibition of RNF138 could be a possibility for the combined tumor therapy with heavy-ions. Whereas upon irradiation with heavy-ions the normal, healthy tissue receives less dose and exhibits DNA lesions of lower complexity, the main part of the energy is deposited in the Bragg-Peak in the target volume, the tumor. As a consequence, contrary to the less complex lesions in the normal tissue, many DNA lesions of high complexity are formed in the tumor volume that require resection dependent repair via CtIP and RNF138. Thus, inhibition of RNF138 could specifically affect the cell survival of tumor cells and be applicable in the tumor therapy in combination with heavy-ion irradiation.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
DFG-Graduiertenkollegs > Research Training Group 1657 Molecular and cellular responses to ionizing radiation
Date Deposited: 08 Apr 2020 13:53
Last Modified: 09 Jul 2020 06:26
DOI: 10.25534/tuprints-00011439
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-114392
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Taucher-Scholz, Prof. Dr. Gisela
Refereed: 7 February 2020
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/11439
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