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Prozessierung und Reparatur von komplexen DNA-Schäden. Mikroskopische Analyse und Quantifizierung des phosphorylierten Histons H2AX und des Tumorsuppressors p53.

Schweinfurth, Yvonne Eva :
Prozessierung und Reparatur von komplexen DNA-Schäden. Mikroskopische Analyse und Quantifizierung des phosphorylierten Histons H2AX und des Tumorsuppressors p53.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2008)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Prozessierung und Reparatur von komplexen DNA-Schäden. Mikroskopische Analyse und Quantifizierung des phosphorylierten Histons H2AX und des Tumorsuppressors p53.
Language: German
Abstract:

Die erfolgreiche Anwendung einer Schwerionenbestrahlung in der Tumortherapie wurde in den letzten Jahren in klinischen Studien gezeigt (Schulz-Ertner et al. 2004, Tsujii et al. 2007). Die verwendeten Kohlenstoffionen zeigen im Tumorbereich, neben der Dosiskonformität, ein reduziertes Überleben der Zellen im Vergleich zu Photonen und somit eine erhöhte biologi-sche Wirksamkeit. Das reduzierte Zellüberleben (Weyrather et al. 1999) und die verminderte Reparierbarkeit der DNA-Doppelstrangbrüche (Heilmann et al. 1996) im Tumorbereich füh-ren zu der Schlussfolgerung, dass der Erfolg der Schwerionen-Therapie auf Unterschieden in der Qualität und Reparierbarkeit der induzierten DNA-Läsionen beruht. In diesem Zusammenhang wurde in der vorliegenen Arbeit die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in Zellen in einem experimentellen Aufbau durchgeführt, welcher die Bestrahlung eines Patienten mit Kohlenstoffionen simulierte. Die Detektion der DNA-Doppelstangbrüche in einzelnen Zellkernen erfolgte mittels immunzytochemischer Markie-rung der phosphorylierten Form des Histons H2AX (γH2AX) und für die Quantifizierung wurde eine Software-basierte, semi-automatische Anwendung etabliert. Im Bereich des ge-sunden Gewebes wurde eine gute Reparierbarkeit der DNA-Läsionen festgestellt, die mit Er-gebnissen für Photonenstrahlen vergleichbar und für die Einschätzung der Späteffekte der Tumortherapie mit Kohlenstoffionen von Bedeutung ist. Im Tumorbereich wurde im Mittel nur ein zusätzlicher persistierender γH2AX-Focus festgestellt - bei einer Wirksamkeit, die im deutlich reduzierten Zellüberleben resultierte und somit auf einzelne, komplexe, nicht repa-rable DNA-Schäden zurückgeführt werden kann. Der Umgang der Zelle mit sehr komplexen, kumulierten DNA-Läsionen wurde analysiert. Um diese DNA-Läsionen zu induzieren, wurde die Bestrahlung mit sehr schweren Ionen he-rangezogen. Dabei zeigte sich, dass mit der Zunahme der lokalen Schadensdichte die Per-sistenz und räumliche Ausdehnung der H2AX-Phosphorylierung zunimmt und sogar in einer globalen Kernphosphorylierung resultiert. Diese Prozesse wurden von Bewegungs- und Um-lagerungsprozessen des geschädigten Chromatins begleitet, wobei ein Einfluss der lokalen Chromatindichte auf die Ausprägung der Phosphorylierung von H2AX festzustellen war. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass auch das im Zusammenhang mit Zellsignalling ste-hende Tumorsuppressorprotein p53 an einzelnen DNA-Doppelstrangbrüchen akkumuliert und an den Stellen der Umlagerungsprozesse von geschädigten Chromatinbereichen vorkommt.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The aim of radiation tumour therapy is to destruct the tumour whilst sparing the healthy tissue to a large extent. The induction of DNA damage, especially the induction of DNA double strand breaks (DSBs), plays an essential role in the radio-therapeutic treatment of cancer. Carbon beams have achieved growing interest for tumour therapy in the last years and the successful application of heavy ion irradiation in the tumour therapy was shown in the clinical studies (Schulz-Ertner et al. 2004, Tsujii et al. 2007). Their inverse dose profile and extreme precision allows target conformal irradiation while sparing the healthy tissue to a large extent. A special feature of carbon ion tumour therapy is the biological action of the ions with enhanced relative biological effectiveness in the tumour volume. The reduced cell survival (Weyrather et al. 1999) and the decreased repair of DNA-Double Strand Breaks (Heilmann et al. 1996) in the tumour lead to the conclusion that the success of the carbon ion therapy is based on the differences in the quality and the repair of the induced DNA-lesions. In this thesis, the induction and repair of DNA-Double Strand Breaks was measured in the experimental model that simulated the therapeutical carbon ion irradiation of a patient. To study DSBs under conditions mimicking therapeutical ion irradiation, cells were exposed to high energy carbon ions in a water phantom. Human fibroblasts or prostate tumour cells were placed in the entrance channel (healthy tissue) and in the extended Bragg-Peak (tumour) region. The molecular marker γH2AX was used for DSB detection. The γH2AX Foci were imaged in the cells by confocal microscopy. For the quantification of the γH2AX signals a software based, semi-automatic procedure was established. In the region of the healthy tissue, the repair of DNA-lesions was comparable with the results of the photon irradiation which is important for the estimation of the late effects of the therapy with carbon ions. However, in the tumour region the level of residual DSBs was slightly but consistently increased after exposure to Bragg peak ions. The residual, irreparable or very slow reparable DNA-lesions after ion irradiation in the tumour region were further characterized by comparing with the behaviour of γH2AX, 53BP1 and Mre11 foci in track segment experiments using carbon or heavier ions. Irradiation with heavy ions under standard and microbeam conditions induced distinct γH2AX foci. For the later time points (> 2 h after irradiation), we observed splitting of the primary γH2AX foci in sub-compartments or smaller foci. The generated secondary foci were localized in different layers of the nucleus and persisted for several days (for very heavy ions). Colocalization with 53BP1, Mre11, PML and p53 was analysed. The dispersion and splitting of ion induced foci was also detected in live cell imaging experiments with HeLa 53BP1-GFP cells. Furthermore, the localisation of the residual γH2AX signals within the nuclear chromatin structure in HeLa-GFP cells was strongly influenced by the chromatin structure. The data obtained contribute to a better understanding of the spatial "reorganisation" of nuclear lesion processing after induction of DSBs.English
Uncontrolled Keywords: gammaH2AX, p53, Ionenbestrahlung, DNA-Reparatur, konfokale Mikroskopie, Chromatinstruktur, Tumortherapie, Bestrahlung mit Kohlenstoffionen
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
gammaH2AX, p53, Ionenbestrahlung, DNA-Reparatur, konfokale Mikroskopie, Chromatinstruktur, Tumortherapie, Bestrahlung mit KohlenstoffionenGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:23
Last Modified: 07 Dec 2012 11:54
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-10271
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Kraft, Prof. Dr. G. and Holstein, Prof. Dr. T. and Layer, Prof. Dr. P.G.
Refereed: 1 February 2008
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/1027
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