Kapillarelektrophorese zur Analyse von komplexen Polyelektrolyten Vom Fachbereich Chemie der Technischen Universität Darmstadt zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktor-Ingenieurs (Dr.-Ing.) genehmigte Dissertation eingereicht von Dipl.-Ing. Karl-Heinz Spriestersbach aus Lahnstein Berichterstatter: PD Dr. H. Pasch Mitberichterstatter: Prof. Dr. H. Vogel Tag der Einreichung: 5.12.2006 Tag der mündlichen Prüfung: 29.01.2007 Darmstadt (2007) D17 Herrn Priv.-Doz. Dr. H. Pasch möchte ich für die interessante Aufgaben- stellung und die hervorragende Betreuung ganz herzlich danken. Des Weiteren möchte ich mich für das in mich gesetzte Vertrauen und den Freiraum bei der Durchführung dieser Arbeit bedanken. Herrn K. Rode möchte ich für die Unterstützung bei den MALDI-TOF-MS- Messungen danken. Weiterhin danke ich Herrn Dr. W. Hiller führ die Durchführung der NMR- Experimente. Ich bedanke mich bei Frau C. Hock und allen nicht namentlich genannten Mitarbeitern der Abteilung Analytik, die mit ihrer Hilfsbereitschaft und Freundlichkeit zu einer sehr angenehmen Arbeitsatmosphäre beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt meiner Familie für die tolle Unterstützung. Diese Arbeit wurde am Deutschen Kunststoff-Institut unter Leitung von PD Dr. H. Pasch in der Zeit von Dezember 2002 bis Dezember 2006 durchgeführt. Meiner Frau Andrea, meinen Kindern Felix und Lea gewidmet Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits auf Tagungen in Form von Vorträgen und als Poster vorgestellt: Vorträge: 1. “Capillary Electrophoresis of polyelectrolytes; a short in Introduction” BASF, 5.12.2005, Ludwigshafen. 2. “Coupling Capillary Electrophoresis and MALDI-TOF-MS for the investigation of synthetic polyelectrolytes” 10-MALDI-Kolloquium-BAM, 9.5.2006, Berlin. Poster: 1. “Capillary Electrophoresis of synthetic polyelectrolytes” 344. WE-Heraeus-Seminar, Understanding the Self-Organization of Charged Polymers, 4-6.4.2005, Bad Honnef. Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung und Aufgabenstellung 1 2. Grundlagen 4 2.1 Elektrophoretische Mobilität 4 2.2 Elektroosmotischer Fluß 6 2.2.1 Parameter zur Kontrolle des EOF 8 2.3 Trenneffizienz und Auflösung in der CE 10 2.4 Temperatureffekte in der CE 12 2.5 Kapillar-Gel-Elektrophorese (CGE) 16 2.5.1 Theorie der CGE 16 2.5.1.1 Überlappungskonzentration 17 2.5.1.2 Maschenweite 18 2.5.1.3 Maschendynamik 19 2.6 Apparativer Aufbau 20 2.7 Detektion 21 2.7.1 Direkte UV-Detektion 21 2.7.2 Indirekte UV-Detektion 22 2.7.3 Kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion 23 2.8 MALDI-TOF-Massenspektrometrie 25 2.8.1 Grundlagen 25 2.8.2 Aufbau eines MALDI-TOF-Massenspektrometers 25 2.9 Polyelektrolyte 28 2.9.1 Polyelektrolyte in Lösung 28 2.9.2 Gegenionenkondensation 30 3. Ergebnisse und Diskussion 32 3.1 Oligomerentrennung von Natriumpolystyrolsulfonat durch CE mit MALDI-TOF-MS-Detektion 32 3.1.1 Verbesserte Isomerentrennung durch Verwendung hoch- konzentrierter Natriumboratpuffer 36 3.1.2 Optimierte Trennung durch Einsatz organischer EOF- Modifier 41 3.1.3 Abhängigkeit der Oligomerentrennung vom Volumenan- teil des eingesetzten Modifiers 48 3.2 Methodenentwicklung zur Trennung und Detektion UV- transparenter Polyelektrolyte 51 3.2.1 Kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion (CCD) 51 3.2.1.1 Vergleich der Trenneffizienz verschiedener organischer Puffersysteme in Abhängigkeit von ihrer Konzentration 54 3.2.1.2 Verbesserte Oligomerentrennung für PAS1,3k durch konzentrierte Arginin/Sorbinsäure-Puffer 57 3.2.1.3 Untersuchung verschiedener Polyacrylsäuresalze mit der kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektion 59 3.2.2 Indirekte UV-Detektion (IUV) 61 3.2.3 Vergleich zwischen CCD und IUV für die Trennung von PAS1,3k mit dem Arginin/Sorbinsäure-Puffer AS6 64 3.2.4 Vergleich der elektrophoretischen Trennung von PAS1,3k und PMAS1,2k 66 3.2.5 Untersuchung verschiedener Polyacrylsäure-Na-Salze mit der indirekten UV-Detektion 69 3.2.6 Bestimmung der Nachweisgrenze der indirekten UV- Detektion 74 3.3 Methodenentwicklung zur Charakterisierung und Detektion UV- transparenter segmentierter Copolymere 76 3.3.1 Indirekte UV-Detektion von segmentierten Copolymeren 76 3.3.2 Leitfähigkeitsdetektion von segmentierten Copolymeren 80 3.3.3 Trennung eines Blends aus MPEG-MAS-Copolymer und MAS-Homopolymer 82 3.4 Methodenentwicklung zur Trennung hochmolekularer Polymethacrylsäure-Na-Salze 85 3.5 Vergleich zwischen der Trenneffizienz der CE und der CGE bei der Trennung eines Blends aus verschiedenen PMAS- und PSS-Standards 90 4. Experimentelle Bedingungen 93 4.1 Apparaturen 93 4.2 Verwendete Software 93 4.3 Leitfähigkeitsdetektor 94 4.4 Kapillarmaterial 94 4.5 Chemikalien 94 4.6 Proben und Standards 95 4.7 Ansetzen der Pufferlösungen 95 4.8 CE-Bedingungen 95 4.9 MALDI-TOF-MS-Messungen 96 5. Zusammenfassung und Ausblick 97 6. Verwendete Abkürzungen und Symbole 101 7. Literatur 105 Einleitung und Aufgabenstellung 1 1. Einleitung und Aufgabenstellung Synthetische Polyelektrolyte gewinnen zunehmend an Bedeutung sowohl in industriellen und pharmazeutischen Anwendungen als auch im Konsum- güterbereich. Als Beispiele seien hier die Anwendungen als Flockungsmittel bei der Abwasseraufbereitung, Superabsorber in Babywindeln, Inkrustations- inhibitoren in Waschmitteln, Betonverflüssiger und Tablettencoatings genannt. Derartige Polyelektrolyte weisen in der Regel komplexe chemische Strukturen auf. Neben der für Polymere üblichen Molmassenverteilung sowie den Uneinheitlichkeiten bezüglich der Funktionalität (unterschiedliche Endgruppen) und der Architektur weisen synthetische Polyelektrolyte unter Umständen noch eine Ladungsverteilung auf. Copolymere weisen weitere Verteilungen auf. So kann der Einbau der Comonomere statistisch, alternierend oder in Blöcken erfolgen. Zusätzlich können Verzweigungen auftreten. Desweiteren können Pfropfcopolymere gebildet werden. Für die Optimierung ihrer Anwendungen und eine zielgerichtete Weiterentwicklung ist eine umfassende Charakterisierung von großem Interesse. Wasserlösliche Polymere tragen polare oder ionische funktionelle Gruppen an den Kettenenden oder entlang der Polymerkette, die zu unterschiedlichen Wechselwirkungen zwischen den Polymermolekülen und z. B. der stationä- ren Phase eines chromatographischen Systems führen können. Aufgrund dieser Wechselwirkungen stellt die Analytik von wasserlöslichen und ionischen Polymeren mit HPLC-Methoden immer noch eine Herausforderung dar. Nicht nur die Molmassenbestimmung mit der SEC, sondern insbesondere auch die Auftrennung von komplexen Copolymeren nach der chemischen Zusammensetzung mit der HPLC wird häufig durch das Vorliegen unterschiedlich geladener Spezies in der Probe gestört. Hier bietet die Kapillarelektrophorese („capillary electrophoresis“, CE) einen entscheidenden Vorteil gegenüber den chromatographischen Methoden. Der Vorteil der CE gegenüber der HPLC bei der Analyse von stark polaren oder ionischen Molekülen liegt darin, dass die die HPLC störenden ionischen Wechselwirkungen im System gezielt für die Trennung genutzt werden können. Auf diese Weise kann z.B. nach der Ladungsdichte von Molekülen aufgetrennt werden. Für ionische Copolymere wäre erwartungsgemäß eine Einleitung und Aufgabenstellung 2 Trennung nach der chemischen Heterogenität zu erreichen. Im Bereich der Bioanalytik hat sich die Kapillarelektrophorese (CE) als wichtiges und leistungsfähiges Instrument erwiesen [1-5]. Die Trennung erfolgt nach dem Ladung-zu-Radius-Verhältnis der Moleküle. Die erreichbaren Trennleistungen sind deutlich höher als in der HPLC und können bis zu 106 theoretische Böden betragen. In der Polymeranalytik ist die CE eine noch weitestgehend neue Methode. In den letzten 10 Jahren haben erste Experimente an Modellpolymeren wie Polystyrolsulfonaten (PSS) und derivatisierten Polyethylenoxiden (PEG) die Anwendbarkeit der CE in der Polymeranalytik gezeigt [6-9]. Es wurde allerdings beschrieben, dass die Trennung von synthetischen Polyelektrolyten in der CE nur für Oligomere möglich ist [10,11]. Die Trennung hochmolekularer Polystyrolsufonat-Proben gelang mit der Kapillargelelektrophorese (capillary gel electrophoresis, CGE). Hierbei werden dem Puffer sogenannte Gelbildner wie z.B. Dextran, Pullulan, PEO oder Hydroxyethylcellulose zugesetzt. Das sich in diesem Puffersystem ausbildende Netzwerk ermöglicht die Trennung der Proben nach dem Molekulargewicht [12-17]. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung von elektrophoretischen Methoden für die Trennung und Charakterisierung von synthetischen Polyelektrolyten. Hierbei sollen zuerst optimierte CE-Trennungen für Oligomere erstellt werden. Durch den Einsatz hochkonzentrierter Puffer sowie durch gezielte Modifizierungen der verwendeten Elektrolytsysteme soll eine verbesserte Oligomerentrennung ermöglicht werden. Die Untersuchun- gen wurden an niedermolekularen Polystyrolsulfonaten durchgeführt. Anschließend soll die Kopplung mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie erstmals eine umfassende Charakterisierung von niedermolekularen Polyelektrolyten ermöglichen. Im Weiteren sollen neue Trenn- und Detektionsverfahren für die CE-Analyse von UV-transparenten Polyelektrolyten entwickelt werden. Die zur Zeit kommerziell erhältlichen CE-Apparaturen sind nur mit spektroskopischen Detektoren wie dem UV- oder dem Laser-induzierten Fluoreszenz-Detektor (LIF) ausgestattet. Dies macht die Analyse UV-transparenter Polyelektrolyte Einleitung und Aufgabenstellung 3 wie z.B. Polyacrylsäure (PAS), Polymethacrylsäure (PMAS) oder Copolymere aus Polyethylenoxid (PEO) und Polymethacrylsäure bzw. Polyacrylsäure mit der CE nahezu unmöglich. In den bisher erfolgten Trennungen von Polyethylenoxiden mit der CE wurde das Detektionsproblem durch Derivatisierung der Proben mit UV-aktiven Reagenzien behoben [8,9]. In der vorliegenden Arbeit wird auf die Derivatisierung der Proben bewusst verzichtet, da diese Derivatisierungsreaktionen in der Regel sehr zeitintensiv sind. Hierbei wird der Vorteil der normalerweise sehr schnellen CE-Analyse wieder zunichte gemacht. Desweiteren sind solche Umsetzungen nie quantitativ. Ebenfalls können unerwünschte Reaktionen, die eine Veränderung der Probe verursachen, nicht vollständig ausgeschlossen werden. In der vorliegenden Arbeit werden Methoden sowohl für die indirekte UV- Detektion als auch für die kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion entwickelt. Diese Methoden werden dann für CE-Untersuchungen von PMAS und PAS angewendet. Komplementär zur SEC und zur HPLC werden Methoden entwickelt, mit denen komplex aufgebaute PEO-PMAS-Copolymere nach der Ladungsdichte und damit der chemischen Zusammensetzung aufgetrennt werden können. Da in der CE hochmolekulare Polyelektrolyte nicht mehr aufgetrennt werden können, wird im Weiteren zur Trennung von hochmolekularen PMAS-Proben nach dem Molekulargewicht eine optimierte Kapillargelelektrophorese- Methode entwickelt. Hierbei wird insbesondere der Einfluss des Molekulargewichts und der Konzentration der eingesetzten Gele auf die Trennung der Proben untersucht. Anschließend wird eine Methode zur Trennung hochmolekularer Polyelektrolyte nach der chemischen Struktur und dem Molekulargewicht anhand verschiedenen PMAS- und PSS-Proben entwickelt. Grundlagen 4 2. Grundlagen 2.1 Elektrophoretische Mobilität In der Kapillarelektrophorese (CE) erfolgt die Trennung der Analytionen aufgrund unterschiedlicher Ionenbeweglichkeiten im elektrischen Feld. Auf ein Ion der Ladung zi wirkt in einem elektrischen Feld die Beschleuni- gungskraft FE: EezF iE ⋅⋅= 0 (1) mit: zi = Ladungszahl e0 = Elementarladung E = elektrisches Feld Da sich die Ionen in einem viskosen Medium - in den meisten Fällen eine wäßrige Lösung – bewegen, wirkt auf sie eine der elektrischen Beschleuni- gungskraft FE entgegengesetzte Reibungskraft FR . Für kugelförmige Teil- chen kann die Reibungskraft FR durch die Stokessche Gleichung beschrieben werden. iiR vrF ⋅⋅⋅⋅= ηπ6 (2) mit: vi = Geschwindigkeit des Ions i η = dynamische Viskosität der Lösung ri = Radius des solvatisierten Ions i Nach einer kurzen Anlaufphase stellt sich ein Gleichgewichtszustand zwischen Beschleunigungskraft und Reibungskraft ein. iii vrEez ⋅⋅⋅⋅=⋅⋅ ηπ60 (3) Das Ion bewegt sich mit der konstanten Geschwindigkeit vi i i i r Eezv ⋅⋅⋅ ⋅⋅ = ηπ6 0 (4) Grundlagen 5 Gleichung 4 besagt, dass die Migrationsgeschwindigkeit eines Ions proportional der elektrischen Feldstärke ist. Den Quotienten aus Geschwindigkeit und Feldstärke bezeichnet man als die absolute Mobilität µa i ii a r ez E v ⋅⋅⋅ ⋅ == ηπ μ 6 0 (5) Nach Gleichung 5 hängt die Mobilität neben den Analytparametern z, e und r nur von der dynamischen Viskosität des Elektrolyten ab, die ihrerseits temperaturabhängig ist. Diese Abhängigkeit kann durch folgenden Ansatz formuliert werden [18,19] ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ ⋅ ⋅= TR Ek Aexpη (6) mit: EA = Aktivierungsenergie R = Gaskonstante T = absolute Temperatur k = Konstante Für geringe Temperaturänderungen kann die Mobilität mit folgender Gleichung abgeschätzt werden [20]. ( )TkTT Δ⋅+= 112 μμ (7) Für wäßrige Lösungen erhält man für k einen Wert von 0,02 K-1. Daraus folgt, dass die Mobilität um 2 % je ein Kelvin Temperaturanstieg zunimmt. Die direkte Berechnung der elektrophoretischen Mobilität ist nicht möglich, da wichtige Parameter, wie die effektive Ladung eines Ions, der hydrodynamische Ionenradius oder der Einfluss aller Elektrolytkomponenten nicht zugänglich sind. Desweiteren gilt Gleichung 5 nur für sphärische Teilchen in unendlich verdünnten Lösungen. Grundlagen 6 Experimentell wird die Mobilität nach folgender Gleichung berechnet: Ut LL Et L i geseff i eff ⋅ ⋅ = ⋅ =μ (8) mit: µ = Mobilität ti = Migrationszeit E = elektrische Feldstärke U = Spannung Leff = effektive Kapillarlänge (Länge bis zum Detektor) Lges = gesamte Kapillarlänge Es ist wichtig zwischen der Gesamtlänge (Lges) und der Länge bis zum Detektor (Leff) zu unterscheiden, da das elektrische Feld über der gesamten Länge der Kapillare abfällt, die Ionen aber nur die effektive Kapillarlänge in der Zeit ti durchwandern. 2.2 Elektroosmotischer Fluß In vielen elektrophoretischen Systemen wird die Wanderung der Ionen vom elektroosmotischen Fluß (EOF) überlagert. Die Wanderungsgeschwindigkeit eines Analytions setzt sich somit additiv aus den Vektoren der Geschwindigkeit des EOF und der Mobilität des Ions zusammen. Als Elektroosmose wird die Bewegung einer flüssigen Phase relativ zu einer stationären, geladenen Oberfläche durch ein angelegtes elektrisches Feld bezeichnet [21]. Im Falle der in der CE verwendeten Quarzglaskapillaren kommt es bei pH-Werten über 4 zur annähernd vollständigen Deprotonierung der Silanolgruppen. Es kommt zur Bildung einer negativen Oberflächenla- dung. Solvatisierte Kationen aus der Elektrolytlösung lagern sich unter Ausbildung einer elektrochemischen Doppelschicht an die negativ geladene Kapillarinnenwand an. Wie in Abb. 1 gezeigt, setzt sich diese Doppelschicht aus einer starren (Helmholtz-Schicht) und einer diffusen (Gouy-Chapman- Schicht) zusammen. Das sich aufgrund der Ladungsverteilung ausbildende Zetapotential ζ fällt nach Stern [22] im Bereich der starren Schicht linear und in der diffusen Schicht exponentiell ab (Abb. 2). Grundlagen 7 Abb. 1: Ladungsverteilung und Ausbildung der Doppelschicht a: starre Helmholtz-Schicht b: diffuse Gouy-Chapman-Schicht c: Elektrolyt Abb. 2: Verlauf des Zetapotentials In der diffusen Schicht der Elektrolytlösung herrscht, da auch die Gegenionen der Silanolgruppen im System verbleiben, ein „Überschuss“ an mobilen hydratisierten Kationen. Liegt parallel zur Oberfläche ein elektrisches Feld an, so werden die Gegenionen in der diffusen Schicht längs der Feldachse beschleunigt. Durch Impulsübertragung wird die gesamte Flüssigkeitssäule im Inneren der Kapillare mitbewegt. Es bildet sich ein extrem flaches kolbenförmiges Strömungsprofil aus. Im Gegensatz zum laminaren Strömungsprofil hydrodynamischer Flüsse bewirkt es praktisch keine zusätzliche Bandenverbreiterung. a b c Quarz a b c ζ x x Grundlagen 8 Die Geschwindigkeit des EOF wird durch die Helmholtz-Smoluchowski- Gleichung beschrieben. BGE r EOF Ev η ζεε ⋅⋅⋅ = 0 (9) mit: vEOF = Geschwindigkeit des EOF εr = relative Dielektrizitätskonstante ε0 = Dielektrizitätskonstante im Vakuum ζ = Zetapotential ηBGE = dynamische Viskosität des „ Back Ground Electrolyte“ Gleichung 9 zeigt, dass die Geschwindigkeit des EOF umgekehrt proportional der Elektrolytviskosität, proportional der Dielektrizitätskonstanten des Elektrolyten, der elektrischen Feldstärke und dem Zetapotential ist. Das Zetapotential wird dabei durch die Oberflächenladungsdichte und die räumliche Ausdehnung der diffusen Schicht bestimmt. Die Ober- flächenladungsdichte ist abhängig vom pH-Wert des Elektrolyten, während die Dicke der Doppelschicht hauptsächlich von der Ionenstärke des Elektrolyten abhängt. Mit Gleichung 10 kann das Zetapotential bestimmt werden. I kT Ne A ⋅ ⋅⋅ ⋅⋅⋅ = ε π ζ 1000 81 2 0 (10) mit: ζ = Zetapotential e0 = Elementarladung NA = Avogadrokonstante ε = Dielektrizitätskonstante des Elektrolyten k = Boltzmannkonstante T = Temperatur I = Ionenstärke des Elektrolyten 2.2.1 Parameter zur Kontrolle des EOF Da dem EOF eine zentrale Rolle bei der elektrophoretischen Trennung in Quarzglaskapillaren zukommt, ist dessen Kontrolle von entscheidender Wichtigkeit. Im Folgenden sind die zur Kontrolle des EOF verfügbaren Parameter und deren Auswirkungen aufgeführt [23]. Grundlagen 9 Parameter Auswirkung pH-Wert Änderung der Oberflächenladung. Zunahme des EOF für zunehmenden pH-Wert. Kann auch die Analytladung beeinflussen. Pufferkonzentration Änderung des Zetapotentials. Zunahme des EOF für abnehmende Pufferkonzentration. Hohe Ionenstärken führen zu höheren elek- trischen Strömen und damit zu einer Erwär- mung des Systems. Temperatur Änderung der Viskosität des Puffers. Zunahme des EOF durch Temperaturerhö- hung. Beeinflussung der Selektivität. Elektrisches Feld Proportionale Änderung des EOF. Höhere Feldstärken führen zu höheren elektrischen Strömen. Dies führt wiederum zur Tempe- raturerhöhung im System. Organische Lösungsmittel Änderung des EOF aufgrund der Änderung der Dielektrizitätskonstanten des Puffers, des Zetapotentials und der Viskosität des Puffers. Tenside Adsorption an der Kapillarwand durch ionische oder hydrophobe Wechselwirkun- gen. Kationische Tenside können den EOF reduzieren oder sogar umkehren. Hydrophile Polymere Bilden eine ungeladene Kapillaroberfläche aus. Unterdrücken den EOF. Tab. 1: Parameter zur Kontrolle des EOF [23] Grundlagen 10 2.3 Trenneffizienz und Auflösung in der CE In Analogie zur Chromatographie wird die Trenneffizienz durch die Höhe eines theoretischen Bodens H und die Anzahl der theoretischen Böden N beschrieben (Gleichung 11). H LN = (11) mit: N = Bodenzahl H = Höhe eines theoretischen Bodens L = Kapillarlänge Die Peakbreite lässt sich durch die Varianz σ2 darstellen. Somit kann H als die auf die Kapillarlänge bezogene Varianz definiert werden (Gleichung 12). L H 2σ = (12) mit: H = Höhe eines theoretischen Bodens L = Kapillarlänge σ2 = Varianz Unter Verwendung des Einsteinschen Diffusionsgesetzes (Gleichung 13) erhält man eine Beziehung zwischen der Bodenzahl N, der Feldstärke E und dem Diffusionskoeffizienten D der Probe (Gleichung 14). U LDL Dt geseff μ σ 2 22 == (13) D UN 2 μ = (14) mit: N = Bodenzahl U = Spannung Leff = effektive Kapillarlänge Lges = Gesamtlänge der Kapillare µ = Mobilität t = Migrationszeit D = Diffusionskoeffizient der Probe Grundlagen 11 Durch die ungefüllte Kapillare und das kolbenförmige Strömungsprofil ist im Gegensatz zur Chromatographie nur die Longitudinaldiffusion für die Bandenverbreiterung verantwortlich. Aus diesem Grund zeigt Gleichung 14, dass die Bodenzahl mit abnehmendem Diffusionskoeffizienten der Probe steigt. Zur praktischen Berechnung der Bodenzahl werden die Migrationszeit und die Peakbreite in halber Höhe verwendet. Die Bodenzahl berechnet sich dann in Analogie zur Chromatographie nach Gleichung 15. 2 5,0 54,5 ⎟ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎜ ⎝ ⎛ ⋅= b tN (15) mit: N = Bodenzahl t = Migrationszeit b0,5 = Peakbreite in halber Höhe Für die qualitative Beschreibung der Trennung zweier Analyten wird die Auflösung R verwendet. Die zur Chromatographie analoge Formel für R zeigt Gleichung 16. eff effNR μ μΔ = 4 mit 12 effeffeff μμμ −=Δ und 2 12 effeff eff μμ μ + = (16) mit: R = Auflösung N = Bodenzahl 21 , effeff μμ = effektive Mobilitäten der beiden Analyten 1 und 2 Grundlagen 12 2.4 Temperatureffekte in der CE Durch das angelegte elektrische Feld wird in der Kapillare ein Stromfluss erzeugt, der zu einer Erwärmung des Elektrolytsystems führt. Für eine mit Puffer gefüllte Kapillare lässt sich die erzeugte elektrische Leistung nach Gleichung 17 berechnen [23]: L dUIRIUP 2 222 κπ ⋅ ⋅⋅=⋅=⋅= (17) mit: P = Elektrische Leistung U = Spannung I = Stromstärke κ = Spezifische Leitfähigkeit des Puffers d = Innendurchmesser der Kapillare L = Kapillarlänge Gleichung 17 zeigt die quadratische Abhängigkeit der elektrischen Leistung von der angelegten Spannung und dem Innendurchmesser der Kapillare sowie die Abhängigkeit von der spezifischen Leitfähigkeit des Puffers. Die mit der elektrischen Leistung verbundene Temperaturänderung führt zu einem Temperaturgradienten innerhalb der Kapillare, der mit Gleichung 18 beschrieben werden kann [24]. b wi k PTTT ⋅⋅ =−=Δ π4 (18) mit: Ti = Temperatur in der Kapillarmitte Tw = Temperatur an der Kapillarinnenwand P = Elektrische Leistung kb = Wärmeleitfähigkeit des Puffers Für eine mit Puffer gefüllte Kapillare lässt sich die durch den Stromfluss erzeugte Wärmemenge nach Gleichung 19 berechnen [25]: cEQ ⋅⋅= λ2 (19) Mit: Q = Wärmemenge pro Volumeneinheit E = Elektrische Feldstärke λ = Molare Leitfähigkeit des Puffers c = Konzentration des Puffers Grundlagen 13 Da die durch die elektrische Leistung erzeugte Wärmemenge nur über die Kapillarwand abgegeben wird, bildet sich im Inneren der Kapillare ein radialer Temperaturgradient senkrecht zur elektrophoretischen Wanderungsrichtung aus. In Abb. 3 ist der sich ausbildende Temperaturgradient schematisch dargestellt. Abb. 3: Temperaturgradient im Puffer und in der Kapillarwand [23] Die Temperaturerhöhung innerhalb einer nicht gekühlten Kapillare kann nach Knox mit folgender Formel berechnet werden: [25] 2,4loglog7,1log −+=Δ QdT i (20) Mit: ΔΤ = Temperaturänderung in der Kapillare di = Kapillarinnendurchmesser Q = Wärmemenge pro Volumeneinheit In Abb. 4 sind die Temperaturänderungen innerhalb einer Kapillare in Abhängigkeit vom Kapillarinnendurchmesser ohne zusätzliche Kühlung für verschiedene Pufferkonzentrationen dargestellt. Die Berechnungen wurden für unterschiedliche Natriumboratpuffer für eine Kapillarlänge von 27 cm und einer Spannung von 15 kV durchgeführt. Die hohen Temperaturänderungen sind jedoch nur von theoretischem Interesse, da bei Erreichen des Siedepunktes der wässrigen Pufferlösung der Stromfluss durch die beginnende Blasenbildung innerhalb der Kapillare unterbrochen wird. Somit sind der Temperaturerhöhung und damit auch der freigesetzten Wärmemenge natürliche Grenzen gesetzt. I: parabolisches Temperaturprofil im Puffer II: exponentielle Temperaturabnahme in der Kapillarwand III: exponentielle Temperaturabnahme im Kühlmedium ID: Kapillarinnendurchmesser I II III Kapillarwand ID Grundlagen 14 25 50 75 100 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 10mM 50mM 100mM Te m pe ra tu rä nd er un g [K ] Kapillarinnendurchmesser [µm] Abb. 4: Abhängigkeit der Temperaturänderung im Inneren einer Kapillare vom Kapillarinnendurchmesser für verschiedene Pufferkonzentrationen. Kapillarlänge: 27 cm, Spannung: 15 kV, Puffer: Natriumborat In Abb. 5 ist die Abhängigkeit der Temperaturerhöhung im Inneren einer Kapillare von der elektrischen Feldstärke bei verschiedenen Pufferkon- zentrationen dargestellt. Der exponentielle Temperaturanstieg verdeutlicht, dass die Verwendung hochkonzentrierter Puffer nur in Kapillaren mit geringem Innendurchmesser und ausreichender aktiver Kühlung möglich ist. Es zeigt sich zudem, dass Trennungen in hochkonzentrierten Puffern nur bei kleinen Feldstärken bzw. kleinen Spannungen durchgeführt werden können. Dies führt unweigerlich zu deutlich verlängerten Analysezeiten. Grundlagen 15 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 10mM 25mM 50mM 80mM 160mM Te m pe ra tu re rh öh un g [K ] Feldstärke [V/cm] Abb. 5: Abhängigkeit der Temperaturänderung von der Feldstärke bei verschiedenen Pufferkonzentrationen ohne Kühlung Kapillare: L = 27 cm, ID = 50µm; Puffer: Natriumborat Verursacht durch die Temperaturerhöhung kommt es ebenfalls zur Ausbildung eines Viskositätsgradienten im Puffer. Bei entsprechend hohen Temperatur- und Viskositätsgradienten kann es zusätzlich noch zu einer Änderung des Strömungsprofils innerhalb der Kapillare von der Kolbenströmung hin zur parabolischen Strömung kommen. Es kommt zur Bandenverbreiterung durch erhöhte thermische Diffusion und aufgrund von Migrationsunterschieden, die durch den Viskositätsgradienten und das parabolische Strömungsprofil verursacht werden. Durch die Temperaturerhö- hung ändern sich zudem sowohl die Dissoziationskonstanten des Puffers als auch der Analyten. Bei Erhöhung der Dissoziationskonstanten des Puffers steigt die Leitfähigkeit, was wiederum zu einer Zunahme der Stromstärke mit den oben beschriebenen Auswirkungen führt. Die durch die Temperaturerhö- hung hervorgerufenen komplexen Änderungen der Trennparameter führen im Allgemeinen zu einer Verringerung der Trenneffizienz und Abnahme der Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse. Grundlagen 16 2.5 Kapillar-Gel-Elektrophorese (CGE) Man mag annehmen, dass die elektrophoretische Mobilität eines Poly- elektrolyten linear mit der Nettoladung der Kette zunimmt. Dies gilt jedoch nur für Oligomere. Für höhermolekulare Polyionen ergibt sich ein nahezu konstantes Oberfläche/Ladungsverhältnis. Hieraus resultiert eine konstante elektrophoretische Mobilität, die eine Trennung in ungefüllten Kapillaren unmöglich macht (siehe Abbildung 6). Im Rahmen des amerikanischen „Genom-Projekts“, das Ende der achziger Jahre des vorigen Jahrhunderts gestartet wurde, entwickelte man die Kapillar-Gel-Elektrophorese zur Trennung hochmolekularer Biomoleküle. Die Trennung in der CGE erfolgt nach der Molekülgröße. Um diese Trennung zu ermöglichen, werden dem Puffer hydrophile Gelbildner als Siebmedium zugesetzt. Diese bilden ein dynamisches, physikalisches Netzwerk aus. Durch entsprechende Wahl des Molekulargewichtes und der Konzentration des zugesetzten Gelbildners ist es möglich, sowohl die Maschengröße des Netzwerkes als auch die Maschendynamik zu bestimmen. Die am häufigsten zum Einsatz kommenden Gelbildner sind Dextran, Pullulan und vor allem Hydroxyethylcellulose. 2.5.1 Theorie der CGE In Abbildung 6 ist die Abhängigkeit der elektrophoretischen Mobilität μ von der Anzahl an Wiederholungseinheiten N schematisch dargestellt [11]. Im Bereich kleiner Oligomere ergibt sich eine lineare Abhängigkeit von μ zu N. Im Übergangsbereich von der Stäbchen- zur Knäuelkonformation durchläuft die Mobilität ein Maximum. Nach Durchlaufen des Maximums nimmt die Mobilität wieder leicht ab, bis sie im Bereich der Knäuelkonformation einen von N unabhängigen konstanten Wert annimmt. Der Bereich der konstanten Mobilität wird für vollständig geladene Polyionen sehr schnell erreicht. So erreicht die Mobilität z.B. für Natriumpolystyrolsulfonat und Polyacrylsäure- Na-Salz ihren konstanten Wert schon bei mittleren Molmassen MW von ca. 2000 g/mol. Grundlagen 17 Abb. 6: Schematische Darstellung der elektrophoretischen Mobilität in Abhängigkeit von der Anzahl der Wiederholungseinheiten für einen vollständig geladenen Polyelektrolyten [11] 2.5.1.1 Überlappungskonzentration Die Überlappungskonzentration C* für Polymerlösungen ist die Konzentra- tion, bei der es durch Überlappung und Verschlaufung der einzelnen Polymerketten zur Ausbildung des Netzwerkes kommt. Die Überlappungs- konzentration C* kann wie folgt ausgedrückt werden [15,26]: AgAg w NR NM NR MC 3 0 3 4 3 4 3 ππ ==∗ (19) mit: Mw = mittlere Molmasse des Gelbildners N = Anzahl an Monomereinheiten pro Polymerkette M0 = Masse der Monomereinheit Rg = Trägheitsradius NA = Avogadrokonstante Für ein athermisches Lösungsmittel erhält man für Rg folgenden Ausdruck [15]: 6,0aNRg = (20) mit: a = Monomerdimensionen N = Anzahl an Monomereinheiten pro Polymerkette Polyion N µep Stäbchen- Konformation Übergang Stäbchen<->Knäuel Knäuel-Konformation kleine Oligomere Grundlagen 18 Setzt man Gleichung 20 in 19 ein, erhält man für die Überlappungs- konzentration folgenden Ausdruck: 3 0 8,0 4 3 aN MN C Aπ − ∗ = (21) Gleichung 21 besagt, dass bei Zunahme der Molekülgröße (N) die Überlappungskonzentration abnimmt. Nach Mitnik [27] kann bei bekanntem Mw die Überlappungskonzentration mit folgender Näherung bestimmt werden: [ ]η 5,1 =∗C (22) Ersetzt man in Gleichung 22 die intrinsische Viskosität [η] durch die Mark- Houwink-Beziehung, [ ] a wKM=η (23) mit: K, a = Mark-Houwink-Parameter Mw = Molmasse kann man die Überlappungskonzentration C* aus den Mark-Houwink- Parametern abschätzen: a wKM C 5,1 =∗ (24) 2.5.1.2 Maschenweite Die Siebeigenschaften des Polymernetzwerkes werden bestimmt durch die Maschenweite und die Maschendynamik bzw. die Lebensdauer einer Masche. Grossmann und Soane schlugen die Abschirmlänge ξ zur qualitativen Beschreibung des Netzwerkes vor [28]. ξ beschreibt die durchschnittliche Entfernung zweier Polymerstränge in einem Polymernetzwerk. Grundlagen 19 4 3 5,0 − ∗ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛⋅= C CRgξ (25) Viovy und Duke führten einen Ausdruck für die Maschenweite, den sog. „blob size“ ξb ein [29]. ξb ist durch einen universellen Vorfaktor mit der Abschirmlänge ξ verknüpft [30]: 4 3 43,186,2 − ∗ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛⋅=⋅= C CRgb ξξ (26) Nach Cottet erhält man durch Kombination von Gleichung 21, 22 und 26 folgende Beziehung für die Maschengröße ξb [15]: 75,0 25,1 75,075,0 043,1 − − = C a NM A bξ (27) Gleichung 27 besagt, dass die Maschenweite eines Polymernetzwerkes von der Konzentration des eingesetzten Gelbildners, nicht jedoch von dessen Kettenlänge abhängt. 2.5.1.3 Maschendynamik Im Gegensatz zu vernetzten Gelen, bilden die verschlauften Polymerlösun- gen dynamische Netzwerke aus. Die Maschendynamik, bzw. die durch- schnittliche Lebensdauer einer Masche kann nach de Gennes wie folgt berechnet werden [31,17]: 3 2 2 2/3 2 63 46 w a a aa a A MCKN kT t − − ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ Φ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛= ππη (28) mit: φ = Flory-Viskositätskonstante K, a = Mark-Houwink-Parameter NA = Avogadrokonstante C = Konzentration des Gels Mw = mittlere Molmasse des Gels Grundlagen 20 Aus Gleichung 28 ist ersichtlich, dass die Lebensdauer und damit die Maschendynamik sowohl von der Konzentration als auch von der mittleren Molmasse des eingesetzten Gelbildners abhängt. Mit den beiden Parametern Maschenweite und Maschendynamik kann man nun für eine gegebene Trennaufgabe ein optimiertes Polymernetzwerk generieren. So wählt man zur Trennung hochmolekularer Proben eher wenig konzentrierte Gellösungen mit einem hohen Molekulargewicht. Für kleinere Probenmoleküle benutzt man hingegen höher konzentrierte Lösungen eines nicht so hochmolekularen Gels. 2.6 Apparativer Aufbau Der schematische Aufbau einer CE-Apparatur ist in Abbildung 7 dargestellt. Die Hauptkomponenten einer solchen Anlage sind die mit Elektrolyt gefüllte Kapillare, die Hochspannungsversorgung, der UV-Detektor, die Druckgasan- lage zur Probeninjektion sowie Gefäße für Proben und Puffer. P uf fe r P ro be UV P uf fe r N2 SpannungKapillare Datenerfassung P uf fe r P ro be UV P uf fe r N2 SpannungKapillare Datenerfassung Abb. 7: Schematischer Aufbau einer CE-Apparatur Bei den verwendeten Kapillaren handelt es sich um Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von 25 bis 100 µm und Gesamtlängen von ca. 25 bis 100 cm. Zur mechanischen Stabilisierung der Kapillaren werden diese außen mit einer Polyimidbeschichtung versehen. Zur Probeninjektion wird an einem Ende der Kapillare das Elektrolytgefäß Grundlagen 21 während der Aufgabe durch ein Probengefäß ersetzt. Die Injektion erfolgt entweder hydrodynamisch oder elektrokinetisch. Die UV-Detektion erfolgt „on-column“. Hierbei wird ein ca 0,5 cm langes Teilstück der Polyimid- schutzschicht entfernt. Das so präparierte Kapillarsegment dient dann als UV-Messzelle. Auf einzelne Detektionsprinzipien wird später noch ausführlich eingegangen. 2.7 Detektion Die häufigsten Detektionsmethoden in der CE sind spektroskopische Methoden wie die UV-Detektion und die Laser-induzierte Fluoreszenzdetek- tion (LIF). Die Detektion erfolgt „on-column“, d.h direkt in der Kapillare. Beispiele für nachgeschaltete Detektionsmethoden sind elektrochemische Detektoren, die Kopplung mit Massenspektrometern oder der Kernresonanzspektroskopie. Im Gegensatz zur Chromatographie wandern die Analytionen mit unter- schiedlichen Geschwindigkeiten durch die Detektionszelle. Diese unter- schiedliche Verweildauer der Ionen im Detektor muss bei der quantitativen Auswertung der Peakflächen berücksichtigt werden. 2.7.1 Direkte UV-Detektion Die UV-Detektion erfolgt wie bereits erwähnt „on-column“. Hierbei dient das von der Polyimidschicht befreite ca. 5 mm lange Kapillarsegment als UV- Messzelle. Für eine Kapillare mit 50 μm Innendurchmesser ergibt sich somit eine Detektorzelle mit einem Volumen von ca. 10 nL. Die UV-Absorption folgt dem Lambert-Beerschen Gesetz. dc I IA d ⋅⋅== ε0log (29) mit: A = Absorption I0 = Intensität des eingestrahlten Lichts Id = Intensität des durchgehenden Lichts ε = molarer Extinktionskoeffizient c = Konzentration d = Schichtdicke Grundlagen 22 d Licht „Z“-Zelle Die geringe Schichtdicke der Detektorzelle wirkt sich natürlich nachteilig auf die Nachweisempfindlichkeit aus. Durch Modifikationen der Zellgeometrie („bubble“-Zelle oder „Z“-Zelle) kann die Empfindlichkeit durch einen verlängerten Lichtweg gesteigert werden [32,33]. Abb. 8: Schematische Darstellung der Detektionszellen mit vergrößerter Zellgeometrie 2.7.2 Indirekte UV-Detektion Viele Polyelektrolytsysteme, insbesondere solche, die Polyacrylsäure oder Polymethacrylsäure enthalten, weisen eine nur schwache UV-Absorption auf, die mit der direkten UV-Detektion kaum nachzuweisen ist. Durch den Einsatz der indirekten UV-Detektion können jedoch auch solche Polyelektrolyte mit einer hohen Empfindlichkeit detektiert werden [23,34,35]. Hierzu werden dem Puffer stark UV absorbierende Ionen zugegeben, die das gleiche Ladungsvorzeichen tragen wie die Analytionen. Diese sogenannten Co-Ionen müssen ähnliche Mobilitäten aufweisen wie die zu untersuchenden Analytionen, um „tailing“- oder „fronting“-Effekte zu vermeiden. Aufgrund der erforderlichen Elektroneutralität im Puffersystem kommt es zu einer Verdrängung der Co-Ionen durch die Analytionen. Im Detektor macht sich dieser Verdrängungseffekt durch eine Abnahme der Extinktion und somit durch einen negativen Peak bemerkbar. Licht d „bubble“-Zelle Grundlagen 23 Abb. 9: Schema der Indirekten UV-Detektion [23] Abb. 10: Peakformen durch Mobilitätsunterschiede a: μCo-Ion > μAnalytion b: μCo-Ion = μAnalytion c: μCo-Ion < μAnalytion 2.7.3 Kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion In der kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektion [36-41] wird die Änderung der elektrischen Leitfähigkeit κ beim Durchgang der Analytionen durch die Detektorzelle gemessen. Als Leitwert L wird der reziproke elektrische Widerstand R in Lösungen bezeichnet (Gleichung 30). R L 1 = mit A lR ⋅ = ρ (30) mit: ρ = spezifischer Widerstand l = Länge der Messzelle A = Fläche der Messzelle Die Leitfähigkeit κ ist der reziproke Wert des spezifischen Widerstandes ρ. t AU a b c Grundlagen 24 Sie ist eine Stoffkonstante, die von der Art und Konzentration der gelösten Ionen, der Temperatur und dem Druck abhängt. Die Konzentrations- abhängigkeit der Leitfähigkeit für starke Elektrolyte wird durch das Quadratwurzelgesetz von Kohlrausch beschrieben. ck−Λ=Λ 0 (31) mit: Λ0 = Grenzleitfähigkeit bei unendlicher Verdünnung k = Boltzmannkonstante c = molare Konzentration In Abbildung 11 ist das Prinzip der kapazitiv gekoppelten kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektion (C4D) [37] dargestellt. Der Detektor besteht aus zwei räumlich von einander getrennten, ringförmigen Elektroden der Länge l, durch die die Kapillare geführt wird. Anders als bei der „on-column-UV- Detektion“ muß hierbei die Polyimidschicht nicht entfernt werden. So kann der Detektor sehr variabel positioniert werden. Die von einem Oszillator erzeugte Wechselspannung wird über die Oszillatorelektrode durch einen kapazitiven Übergang ins Innere der Kapillare übertragen, durchläuft den Detektionsspalt d und wird nach einem weiteren kapazitiven Übergang auf die Verstärkerelektrode gleichgerichtet und verstärkt. Abb. 11: Schematische Darstellung des C4D-Detektors C1 R C2 Oszillator Verstärker d lElektroden Kapillare Grundlagen 25 Die Detektion erfolgt in Abhängigkeit von der Leitfähigkeit des Elektrolyten entweder im direkten oder im indirekten Modus. Für die direkte Detektion muss der Elektrolyt eine geringere Leitfähigkeit als die zu untersuchenden Analytionen aufweisen. Im indirekten Modus verwendet man hingegen Puffer mit einer sehr hohen Leitfähigkeit (z.B. Borat- oder Phosphat-Puffer). 2.8 MALDI-TOF-Massenspektrometrie 2.8.1 Grundlagen Die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) ist eine relativ neue und leistungsfähige Methode in der Polymeranalytik [42-45] zur Charakterisierung von Molmassen, Molmassen- verteilungen, Monomereinheiten und Endgruppen. Anders als die herkömmliche Massenspektrometrie (MS) ist die MALDI-MS eine schonende Methode, bei der die Probenmoleküle in der Regel nicht fragmentiert, sondern unzersetzt in die Gasphase überführt und hier durch Anlagerung von Kationen ionisiert werden. Hierbei kommt der Matrix eine essentielle Aufgabe zu. Diese muss das zu untersuchende Polymer verdünnen, indem es ein Cokristallisat mit den Probenmolekülen bildet, die Laserenergie absorbieren (meist ein UV-Laser bei 337 nm und einer Pulsdauer von 3-5 ns) und die aufgenommene Energie auf die Polymermoleküle übertragen. Die Detektion erfolgt anschließend in einem Flugzeitmassenspektrometer (TOF-MS). 2.8.2 Aufbau eines MALDI-TOF-Massenspektrometers Massenspektrometer bestehen im wesentlichen aus einer Schleuse für den Probeneinlass, einer Ionenquelle, einem Analysator und einem Detektor. Den schematischen Aufbau eines MALDI-Massenspektrometers zeigt Abb. 12. Bei MALDI-Massenspektrometern wird Laserlicht über Spiegel und eine Fokussierungseinheit auf die Probenoberfläche gelenkt, wodurch die Proben- moleküle desorbiert und ionisiert werden. Nach der Ionisierung werden die Ionen durch Anlegen eines elektrischen Feldes beschleunigt und in den Flugzeitanalysator gelenkt. Nach dem Durchlaufen der Beschleunigungs- Grundlagen 26 strecke (1) besitzen Moleküle gleicher Ladung die gleiche kinetische Energie, welche durch die angelegte Beschleunigungsspannung gegeben ist. Die Geschwindigkeit v, mit der die Ionen die Driftstrecke (2) bis zum Detektor zurücklegen, ist hierbei abhängig von der Ionenmasse m (Gl. 32). 2 2 1 mvEkin = (32) Die Flugzeit T bis zum Detektor berechnet sich nach (Gl. 33): Uz msT ⋅⋅ ⋅= 2 (33) mit s: Flugstrecke m: Molmasse z: Ladungszahl U: Beschleunigungsspannung Nach der Driftstrecke, die durch ein Pumpensystem ständig unter Hochvakuum gehalten wird, treffen die Ionen auf den Detektor. Aus der Flugzeit kann nun das Masse-Ladungsverhältnis m/z ermittelt werden. Die Massenkalibrierung der Flugzeitachse erfolgt mit Eichstandards. N2-Laser (337 nm) Spiegel Filter Linse Linear-Detektor Schleuse mit Probeneinlass Reflektron-Detektor Reflektron Probenträger (1) (2) Abb. 12: Schematischer Aufbau eines MALDI-Massenspektrometers Grundlagen 27 In kommerziellen MALDI-TOF-Massenspektrometern werden Beschleuni- gungsspannungen von 20-30 kV verwendet. Bei der Desorption von Ionen mit gleichem Masse-Ladungsverhältnis tritt häufig eine Flugzeitverteilung auf. Dies rührt daher, dass die Ionen eine Ortsverteilung, eine unterschiedliche Desorptionszeit sowie eine unterschiedliche Ionisierungszeit aufweisen können. Durch verzögerte Ionenextraktion werden diese Effekte teilweise wieder ausgeglichen, was zu einer deutlich verbesserten Auflösung führt. Die verzögerte Ionenextraktion wird durch eine zeitliche Verzögerung zwischen dem Laserimpuls und dem Einschalten der Beschleunigungsspannung erreicht. Durch diese Verzögerung driften Ionen mit einer höheren Anfangsgeschwindigkeit tiefer in die Beschleunigungszone und werden nach Einschalten des Feldes entsprechen geringer beschleunigt. Die am Anfang langsameren Ionen werden nun dem Beschleunigungsfeld länger ausgesetzt, so dass im Idealfall die zu Beginn der Desorption aufgetretenen Verteilungen aufgehoben werden und alle Ionen mit gleichem m/z-Verhältnis gleichzeitig detektiert werden [46]. Die Detektion erfolgt entweder nach Zurücklegen einer linearen Flugstrecke im Lineardetektor oder nach Umlenkung der Flugbahn im Reflektron- Detektor. In einem Reflektron werden die Ionen durch ein elektrisches Feld gebremst und umgelenkt. Ionen mit einer höheren kinetischen Energie dringen tiefer in den Reflektron ein und durchlaufen somit eine längere Wegstrecke. Durch geeignete Einstellungen können unterschiedliche Geschwindigkeiten bei Ionen mit gleichem m/z-Verhälnis ebenfalls ausgeglichen werden. Somit dient der Reflektron-Modus wie auch die verzögerte Ionenextraktion zur Verbesserung der Signalauflösung. Für die Detektion werden in der Regel Sekundärionenvervielfacher eingesetzt. Grundlagen 28 2.9 Polyelektrolyte Polyelektrolyte sind Polymere die eine große Anzahl ionisierbarer Gruppen tragen. Für den Fall, dass jede Monomereinheit eine Ladung e trägt, spricht man von einem Makroion. In geeigneten Lösungsmitteln (i.a. Wasser) dissoziieren diese in hochgeladene Polyionen und eine entsprechende Anzahl niedermolekularer Gegenionen. Das hierbei auftretende elektrosta- tische Potential ist eine der Hauptursachen für das abweichende Verhalten der Polyelektrolyte von dem neutraler Polymere in Lösung. 2.9.1 Polyelektrolyte in Lösung Die Konformation der Polyelektrolytketten in Lösung wird, im Vergleich zur Konformation neutraler Makromoleküle, maßgeblich durch die zusätzlich auftretende langreichweitige Coulomb-Wechselwirkung entlang und zwischen den einzelnen Ketten beeinflusst. Der Einfluss der lokalen Ionen („Salzabhängigkeit“) ist ebenfalls von Bedeutung für das Konformations- verhalten von Polyelektrolyten in Lösung. Zur Beschreibung dieses Verhaltens kann das von Skolnick, Fixman [47] und Odijk [48,49] entwickelte sogenannte „wormlike chain“- Modell herangezogen werden. Ein zentraler Parameter dieses Modells ist die elektrostatische Persistenzlänge Pel , die den Beitrag der Coulomb-Wechselwirkungen zur Persistenzlänge beschreibt. Die Persistenzlänge P ist ein Maß für die Kettenflexibilität und gibt die Länge an, nach der innerhalb einer Kette die Richtungskorrelation bezüglich der ersten Einheit abgeklungen ist. Die Persistenzlänge für Polyelektrolyte ist größer als die Persistenzlänge analoger neutraler Polymere, da die elektrostatischen Wechselwirkungen einem Verbiegen der Kette entgegenwirken. Sie setzt sich aus zwei Komponenten, der intrinsischen P0 für die neutrale Kette und der elektrostatischen Pel zusammen. elPPP ⋅= 0 (34) mit: P = Persistenzlänge P0 = Intrinsische Persistenzlänge Pel = Elektrostatische Persistenzlänge Grundlagen 29 Die elektrostatische Persistenzlänge Pel kann wie folgt beschrieben werden: 2224 fd lP b el ⋅⋅⋅ = κ (35) mit: lb = Bjerrum-Länge κ = Abschirmkonstante d = Abstand zweier Ladungen auf der Kette f = Faktor, der die effektive Ladung der Kette berücksichtigt Für den Faktor f gilt nach Manning: f=1 für d>lb und f=lb/d für d1 erfolgt Gegenionenkondensation bis der Maximalwert 1 erreicht ist [50]. d lb=ξ (39) mit: ξ = Ladungsdichte lb = Bjerrum-Länge d = Ladungsabstand auf der Kette Ergebnisse und Diskussion 32 3. Ergebnisse und Diskussion 3.1 Oligomerentrennung von Natriumpolystyrolsulfonat durch CE mit MALDI-TOF-MS-Detektion Die CE ist eine sehr empfindliche und schnelle analytische Methode. Sie eignet sich hervorragend zur Oligomerentrennung synthetischer Poly- elektrolyte. Cottet zeigte, dass es möglich ist, ein niedermolekulares Natriumpolystyrolsulfonat mit einer mittleren Molmasse von 1100 g/mol in einzelne Oligomere aufzuspalten [54]. In einer Arbeit von Pasch und Hiller [55] konnte gezeigt werden, dass neutrales Oligostyrol durch geeignete HPLC-Bedingungen ebenfalls in die einzelnen Oligomere aufgetrennt werden kann. Das 1H-NMR-Experiment zeigte weiterhin die zu erwartenden isomeren Strukturen der einzelnen Oligomere. Für das Dimere wurden 2 Isomere, für das Trimere 4 Isomere und für das Tetramere 8 Isomere identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde nun untersucht, ob es durch optimierte elektrophoretische Bedingungen auch für das PSS möglich ist, neben den Oligomeren auch die isomeren Verbindungen aufzutrennen. Mit diesen Untersuchungen sollten die Grenzen der CE aufgezeigt werden. Für die in Abb. 14 dargestellte Auftrennung einer Natriumpolystyrolsulfonat- Probe kam ein vergleichsweise hochkonzentrierter Natriumborat-Puffer mit einer Konzentration von 160 mM und einem pH-Wert von 9 zum Einsatz. Üblicherweise werden in den meisten veröffentlichten CE-Anwendungen Pufferkonzentrationen von 5 bis 100 mM verwendet. Die Geschwindigkeit des sich unter diesen experimentellen Bedingungen ausbildenden EOF wird direkt durch die Pufferkonzentration beeinflusst. Mit zunehmender Pufferkonzentration nimmt die EOF-Geschwindigkeit ab. Dies führt zu einer scheinbaren Verlangsamung der Anionen. Es kommt zu einer verlängerten Verweilzeit der Anionen in der Kapillare und damit zu einer verbesserten Auftrennung. Man muss jedoch beachten, dass mit zunehmender Pufferkonzentration auch die auftretende Stromstärke zunimmt. Dies führt zu einer Erwärmung des Systems („Joule-Heating“), die sich nachteilig auf die Trenneffizienz auswirken kann. Ergebnisse und Diskussion 33 Abb. 14: Elektropherogramm von PSS1.1k Kapillare: 32 cm L x 50 µm ID, unbeschichtet Puffer: 160 mM Natriumborat U: 15kV; Inj: 3s x 0,5psi; T: 23°C; UV: 200nm In dem in Abb. 14 gezeigten Elektropherogramm des Natriumpolystyrol- sulfonat-Standards (PSS1.1k) sind die Oligomerenpeaks N1 – N5 deutlich zu erkennen. Bei genauerer Betrachtung weisen die Oligomerenpeaks Substrukturen auf, die mit zunehmendem Polymerisationsgrad immer komplexer werden. Diese Substrukturen können verschiedene Ursachen haben. So können unterschiedliche Sulfonierungsgrade, verschiedene Isomere oder auch unterschiedliche Ladungsdichten, hervorgerufen durch unvollständige Dissoziation der Sulfonat-Gruppen, für das Auftreten der Substrukturen verantwortlich sein. Mit den zur Verfügung stehenden UV- und Leitfähigkeitsdetektoren ist es nicht möglich, Art und Ursache der Substrukturen aufzuklären. Das Problem, das sich bei der Auswertung eines solchen Elektropherogramms ergibt, ist die genaue Zuordnung der erhaltenen Peaks zu entsprechenden Strukturinformationen. In der Analytik kleiner anorganischer oder organischer Moleküle erfolgt die Identifizierung der Peaks anhand der individuellen Migrationszeiten. Da für solche Analytionen das exakte Verhältnis von Ladung-zu-Radius im 0 2 4 6 8 10 12 14 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 AU Migrationszeit [min] N5 N1 N4 N2 N3 Ergebnisse und Diskussion 34 Allgemeinen bekannt ist, können die Peaks im Elektropherogramm eindeutig zugewiesen werden. Diese Bestimmung ist für synthetische Polyelektrolyte jedoch nur bedingt möglich. Synthetische Polyelektrolyte weisen neben einer Molmassenverteilung im ungünstigsten Fall auch eine Verteilung der Ladungsdichte auf. So ist es durchaus denkbar, dass die Peakaufspaltung in Abb. 11 durch unterschiedliche Ladungsdichten ein und desselben Mole- kulargewichts hervorgerufen wird. Im Falle eines wohl definierten Standards ist die Zuordnung relativ einfach. Schwierig wird es jedoch bei der Identifizierung von industriellen Proben oder noch nicht vollständig charakterisierten Substanzen. Um sowohl die Oligomere der Natriumpolystyrolsulfonat-Probe exakt zuordnen sowie die Natur der Substrukturen erklären zu können, bot sich die Kopplung der CE und der MALDI-TOF-MS an. Im Falle des in Abb. 14 dargestellten Polystyrolsulfonats wurden die Peaks N2 und N3 fraktioniert und anschließend einer MALDI-TOF-Analyse unterzogen. Ebenfalls wurde zum Vergleich die Gesamtprobe mit MALDI-TOF untersucht. Um eine für die MALDI-TOF-Analyse ausreichende Probenmenge zu erhalten, wurden die Peaks N2 und N3 jeweils 10 mal fraktioniert. Die Fraktionen wurden mit einem Überschuss an Matrix vermischt, auf den Probenträger aufgetragen, getrocknet und über eine Vakuumschleuse in das Massenspektrometer überführt. Die Detektion erfolgte im Linear-Modus bei negativer Polarisation. Als Matrix wurde eine Lösung von 5mg Harmin (C13H12N2O) in 1 ml THF verwendet. In Abb. 15 sind die drei Massenspektren dargestellt. Spektrum 1 zeigt das Massenspektrum der Gesamtprobe. Neben den Massenpeaks für Matrixfrag- mente bei 486 Da und im Bereich von 800 – 900 Da zeigt das Spektrum eine Peakserie mit Masseninkrementen von jeweils 184 Da. Dieses Masseninkre- ment entspricht der Styrolsulfonsäure-Wiederholungseinheit. Die Endgruppen wurden zu Massen von 57 Da (n-Butylgruppe) und 1 Da (Wasserstoffatom) bestimmt. So kann der Peak mit der Masse von 425 Da eindeutig dem Dimeren, der Massenpeak bei 610 Da dem Trimeren zugeordnet werden. Ergebnisse und Diskussion 35 Abb. 15: Massenspektren der Gesamtprobe (Spektrum 1), der Fraktion N2 (Spektrum 2) und Fraktion N3 (Spektrum 3) In Abb. 16 sind die möglichen Isomere für das Dimere und das Trimere gezeigt. Spektrum 2 zeigt die Fraktion N2. Neben den wiederum auftretenden Matrixpeaks ist nur ein einziger Peak mit der Masse von 425 Da zu erkennen. In Spektrum 3 ist ebenfalls nur ein Peak mit der Masse von 610 Da zu erkennen. Aus der MALDI-TOF-Analyse lassen sich nun die beiden Fraktionen eindeutig identifizieren. Fraktion N2 enthält das Dimere mit der Masse von 425 Da während Fraktion N3 nur das Trimere mit der Masse von 610 Da aufweist. Abb. 16: Schematische Darstellung der isomeren Strukturen für die Oligomere N2 und N3 Dimer (N2): Trimer (N3): XX R X R X XX R X XX R X X X R X X X R X R: n-Butyl X: SO3H N=2 N=3 3 2 1 N=2 N=3 3 2 1 3 2 1 Ergebnisse und Diskussion 36 Die in Abb. 14 auftretenden Substrukturen der Oligomerenpeaks können verschiedene Ursachen haben. Auch zur Klärung dieser Frage konnte die MALDI-TOF-MS beitragen. Da die Trennung in der CE nach dem Verhältnis von Ladung-zu-Radius erfolgt, ist es denkbar, dass die Substrukturen durch Konformationsisomere verursacht werden. Ebenfalls kann eine unterschied- liche Anzahl an Sulfonatgruppen zu dieser Feinaufspaltung führen. Des Weiteren können auch unterschiedliche Dissoziationsgrade der Sulfonatgrup- pen und damit unterschiedliche Ladungsdichten diese Aufspaltung hervorrufen. Für den Fall, dass die Substruktur durch eine unterschiedliche Anzahl an Sulfonatgruppen verursacht würde, müsste man im Massenspektrum Satellitenpeaks mit einer um +/- 80 Da verschobenen Masse finden. Diese konnten jedoch weder für das Dimere noch für das Trimere beobachtet werden. Somit kann dieser Fall ausgeschlossen werden. Da der Puffer einen pH-Wert von 9 hat, kann davon ausgegangen werden, dass die Dissoziation der Sulfonatgruppen nahezu vollständig ist. Somit bleiben als Erklärung nur die isomeren Strukturen übrig, die zu dieser Aufspaltung führen. Da Isomere mit MALDI-TOF-MS nicht nachgewiesen werden können, ist dies jedoch nur ein indirekter Beweis. 3.1.1 Verbesserte Isomerentrennung durch Verwendung hochkonzent- rierter Natriumboratpuffer In Abb. 14 wurde gezeigt, dass die Oligomere des Polystyrolsulfonats bei der CE-Trennung in Isomere aufspalten. Ziel der folgenden Untersuchung ist es, diese Isomerentrennung zu optimieren. In der Abb. 17 sind die Elektro- pherogramme für verschiedene Pufferkonzentrationen dargestellt. Die Natriumborat-Puffer werden aus Di-Natrium-Tetraborat hergestellt. Es werden Puffer mit Konzentrationen von 160 mM, 240 mM und 320 mM und pH-Werten von jeweils 9 eingesetzt. Um die bei diesen hohen Puffer- konzentrationen zu erwartenden hohen Ströme besser handhaben zu können, werden die Trennungen in einer Kapillare mit geringem Innendurchmesser durchgeführt. Es wird eine 37 cm lange Quarzglas- kapillare mit einem Innendurchmesser von 25 µm verwendet. Die Ergebnisse und Diskussion 37 auftretenden Stromstärken liegen im Bereich von ca. 10 bis 25 µA. Durch eine effektive Kühlung der Kapillare kann die bei diesen Stromstärken auftretende Erwärmung des Puffersystems vernachlässigt werden. Abb. 17: Elektropherogramme bei unterschiedlichen Pufferkonzentrationen A: 320 mM Natriumborat; B: 240 mM Natriumborat; C: 160 mM Natriumborat Kapillare: 37 cm x 25µm I.D.; unbeschichtet U: 15kV; Inj: 15s x 0,5 psi; T: 23°C; UV: 200nm In Abb. 17 ist der Einfluss der Pufferkonzentration auf die Qualität der Trennung zu sehen. Betrachtet man das Peakmuster des Trimeren (N=3) erkennt man, dass mit zunehmender Pufferkonzentration die Anzahl an sichtbaren Isomerenpeaks zunimmt. Für den 320 mM Natriumboratpuffer erhält man 7 Peaks die teilweise basisliniengetrennt sind. Ebenfalls ist der Einfluss auf die Geschwindigkeit des EOF und damit auch auf die benötigte Trennzeit deutlich zu sehen. Während bei einer Pufferkonzentration von 160 mM (Kurve C) die gesamte Probe innerhalb 50 min getrennt und detektiert wird, kann für den hochkonzentrierten Natriumboratpuffer (Kurve A) im selben Zeitraum nur noch bis zum Trimeren detektiert werden. Bei der Verwendung eines hier nicht gezeigten Natriumboratpuffers mit einer Konzentration von 400 mM wird die Trenndauer so groß, dass in adäquater Zeit nur noch das Monomere detektiert werden kann. Da durch die 0 10 20 30 40 50 -0,04 -0,02 0,00 0,02 C A U Migrationszeit [min] 0 10 20 30 40 50 -0,04 -0,02 0,00 0,02 B A U 0 10 20 30 40 50 -0,04 -0,02 0,00 0,02 A A U N=3 N=3 N=3 N=4 N=4 N=2 N=2 N=2 Migrationszeit [min] Ergebnisse und Diskussion 38 Verringerung der Geschwindigkeit des EOF auch die effektiven Mobilitäten der Analytionen verringert werden, kommt es für die höheren Oligomere zu so starken Peakverbreiterungen, dass die Peaksignale im Basislinienrauschen verschwinden. In Abb. 18 ist die Aufspaltung für das Trimere vergrößert dargestellt. Kurve A zeigt die Aufspaltung für die Pufferkonzentration von 320 mM. Kurve B zeigt das Peakmuster für die Pufferkonzentration von 240 mM. Abb. 18: Feinaufspaltung des Trimeren von PSS1.1k für verschiedene Pufferkon- zentrationen A: 320 mM Natriumborat; B: 240 mM Natriumborat In Kurve A (Abb. 18) ist die Aufspaltung des Trimeren in 7 Peaks deutlich zu erkennen. Im Vergleich zur Trennung mit herkömmlichen Pufferkonzentratio- nen von ca. 10 mM bis maximal 100 mM (Abb. 14) kann die Auftrennung bei Verwendung von hochkonzentrierten Puffern signifikant verbessert werden. Bei näherer Betrachtung dieses Ergebnisses stellt sich die Frage, wodurch die Feinaufspaltung in 7 diskrete Peaks verursacht wird. Wie oben erwähnt, konnten Pasch und Hiller für das Trimere eines Oligostyrols im 1H-NMR vier 18 20 22 24 26 28 30 -0,03 -0,02 -0,01 0,00 B A U Migrationszeit [min] 26 28 30 32 34 36 38 -0,03 -0,02 -0,01 A A U N=3 N=3 Ergebnisse und Diskussion 39 verschiedenen Konformationsisomere nachweisen. Die zusätzliche Zahl an Peaks, die in der CE erreicht wird, lässt darauf schließen, dass zusätzlich zu den Konformationsisomeren unterschiedliche Substitutionen der Sulfonat- Gruppen an den Aromaten zu dieser Feinaufspaltung führen. Um diese Annahme zu überprüfen, wurden eine 13C-NMR-Messung und ein DEPT- Experiment der Gesamtprobe vorgenommen. Bei der DEPT-Messung handelt es sich um ein 13C-NMR-Experiment, bei dem durch eine entsprechende Pulssequenz nur CH-, CH2- und CH3-Gruppen angeregt werden. Alle Signale der 13C-NMR-Messung, die durch quarternäre C-Atome hervorgerufen werden, sind im DEPT-Spektrum nicht vorhanden. In Abb. 19 ist das 13C-Spektrum (A) und das DEPT-Spektrum (B) dargestellt. Abb. 19: 13C-NMR (A) und DEPT (B) von Polystyrolsulfonat PSS1.1k Im 13C-Spektrum erkennt man 5 Signale im Bereich der Aromatenresonanz zwischen 125 und 152 ppm. Die Signale bei 126 und 129 ppm werden durch die aromatischen CH-Gruppen erzeugt. Die drei Signale bei 141-, 147- und 150 ppm verschwinden im DEPT-Spektrum (B) und können deshalb den quarternären Ring-C-Atomen zugeordnet werden. Um die beobachteten 2030405060708090100110120130140150 ppm Produktname Polystyrol Charge Nr. 1 C13 von Polystyrolsulfonat 2030405060708090100110120130140150 ppm A B Ergebnisse und Diskussion 40 Signale den verschiedenen Substitutionen zuordnen zu können, wurden mit Hilfe des ACD/Labs 8.0-Programms der Firma Advanced Chemistry Development, Inc.,Toronto, Kanada die 13C-NMR-Spektren für die para-, meta- und ortho-Substitutionen berechnet. In Abb. 20 sind die berechneten chemischen Verschiebungen für die verschiedenen Substitutionen dargestellt. Abb. 20: Berechnete chemische Verschiebungen der quarternären C-Atome für die unterschiedlichen Substitutionen Die Signale bei 141 ppm (C4) und 152 ppm (C1) in Abb. 19, Spektrum A, können der Struktur mit der para-Position der Sulfonatgruppe zugewiesen werden. Das Signal bei 147 ppm kann sowohl der C1-Position der meta- als auch der ortho-Position zugewiesen werden. Eine weitere Unterscheidung zwischen der meta- und der ortho-Substitution ist hier nicht möglich. Das NMR-Experiment konnte jedoch zeigen, dass es neben der para-Substitution noch weitere Substitutionen in der vorliegenden Polystyrolsulfonat-Probe gibt. Der Nachweis der unterschiedlichen Substitutionen kann als Erklärung für die in der CE erreichte Feinaufspaltung des Trimeren in sieben diskrete Peaks herangezogen werden. Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, unterschiedliche Isomere und unterschiedliche Substitutionen der Sulfonatgruppen an den Aromaten mit der CE zu trennen und nachzuweisen. X X X = C1 = 150 – 152 ppm = C4 = 140 ppm = C1 = 146 – 148 ppm = C3 = 135 ppm = C1 = 145 – 147 ppm = C2 = 135 ppm Ergebnisse und Diskussion 41 3.1.2 Optimierte Trennung durch Einsatz organischer EOF-Modifier Schwer und Kenndler haben gezeigt, dass durch Zugabe niedermolekularer Alkohole und Acetonitril als sogenannte organische Modifier zum Puffer- system die Auflösung elektrophoretischer Trennungen verbessert werden kann [56]. Ursächlich hierfür ist eine Verringerung der EOF-Geschwindigkeit aufgrund der Änderungen der Dielektrizitätskonstante, der Viskosität und des Zeta-Potentials des Puffersystems. Durch die Verringerung der EOF- Geschwindigkeit kommt es zu einer verlängerten Verweilzeit der Analytionen in der Kapillare, die zu einer verbesserten Auftrennung führt. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob durch Zugabe organischer Modifier zum Puffersystem die Auftrennung synthetischer Polyelektrolyte ebenfalls verbessert werden kann. Hierzu wurde der Einfluss des verwendeten Modifiers auf die Trennung der Oligomere für Natrium- polystyrolsulfonat untersucht. Für die folgenden Untersuchungen wurden Natriumboratpuffer mit Konzentrationen von 80, 160, 240 und 320 mM und pH-Werten von 9 verwendet. Diesen wurden jeweils 10 Volumenprozent (% v/v) eines organischen Modifiers zugesetzt. Zur Überprüfung der Trenneffizienz wurde ein Natriumpolystyrolsulfonat-Standard mit einem mittleren Molekulargewicht von 1100 g/mol (PSS1.1k) als Probensubstanz eingesetzt. Die Trennungen wurden in einer unbeschichteten Quarzglas- kapillare mit einer Gesamtlänge von 27 cm und einem Innendurchmesser von 25 µm bei einer Spannung von 10 kV durchgeführt. Als Modifier kamen Ethanol (EtOH), Isopropanol (Iso) und Acetonitril (ACN) zum Einsatz. Die Modifier müssen eine gute Mischbarkeit mit dem wässrigen Puffer aufweisen. Ebenfalls muss bei höheren Modifierkonzentrationen im Puffergemisch eine ausreichende Löslichkeit des Natriumborats gegeben sein. Desweiteren sollten die Modifier im gewählten Detektionsbereich von 200 nm eine ausreichende UV-Transparenz aufweisen. Um die durch die Zugabe der Modifier auftretende Verdünnung auszugleichen, wurde den Pufferstamm- lösungen zur Vergleichsmessung ebenfalls 10 % v/v Wasser als „inerter“ Modifier zugesetzt. In den Abbildungen 21 - 24 sind die Elektropherogramme der Probe PSS1.1k in Abhängigkeit von der Pufferkonzentration und der Art des Ergebnisse und Diskussion 42 Modifiers dargestellt. Man erkennt, dass die Auftrennung der Oligomere bei allen Pufferkonzentrationen vom reinen Puffer über Acetonitril, Isopropanol hin zu Ethanol deutlich zunimmt. Parallel hierzu nimmt jedoch auch die Trennzeit zu. So ist im Falle des 80 mM Natriumboratpuffers eine Verdopplung der Trennzeit zwischen der schnellsten Trennung für den reinen Puffer und der langsamsten, aber auch besten, Trennung für Ethanol zu erkennen. Diese Effekte sind für alle Pufferkonzentrationen zu beobachten. Für den höchst konzentrierten Puffer (320mM) ist die Trennung so langsam, dass in der vorgegebenen experimentellen Zeit von 50 Minuten nur noch die Oligomere N1 und N2 detektiert werden können. Abb. 21: Elektropherogramme von PSS1.1k in B80 mit unterschiedlichen Modifiern 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,00 0,03 0,06 0,09 10% H2O A U Migrationszeit [min] 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,00 0,03 0,06 10% ACNA U 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,00 0,03 0,06 10% IsoA U 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,00 0,03 0,06 80 mM Borat 10% EtOHA U N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 Ergebnisse und Diskussion 43 Abb. 22: Elektropherogramme von PSS1.1k in B160 mit unterschiedlichen Modifiern Abb. 23: Elektropherogramme von PSS1.1k in B240 mit unterschiedlichen Modifiern 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,00 0,02 0,04 10% H2O A U Migrationszeit [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,00 0,02 0,04 10 % ACNA U 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,00 0,02 0,04 10% IsoA U 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,00 0,02 0,04 160 mM Borat 10% EtOHA U N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 0,04 10% H2O A U Migrationszeit [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 0,04 10% ACN A U 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 0,04 10% Iso A U 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 0,04 240 mM Borat 10% EtOH AU N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 N1 N2 N3 Ergebnisse und Diskussion 44 Abb. 24: Elektropherogramme von PSS1.1k in B320 mit unterschiedlichen Modifiern In Abb. 25 sind die Migrationszeiten der Oligomere N1 – N3 in Abhängigkeit von der Art des Modifiers aufgetragen. Man erkennt, dass die Migrationszeiten durch Zugabe der Modifier zunehmen. Parallel hierzu erzielt man deutlich verbesserte Auftrennungen der Oligomerenpeaks. Hierbei ist der Einfluss von Acetonitril auf die Änderung der Migrationszeiten im Vergleich zum reinen Puffer nur gering. Für Isopropanol und Ethanol erhält man jedoch deutlich größere Änderungen der Migrationszeiten. So werden die Migrationszeiten durch Zugabe von 10 Vol.% Ethanol zum Puffer um den Faktor 2 verlängert. Aufgrund der größeren Änderungen der Migrationszeiten erhält man für Ethanol als Modifier die besten Trennergebnisse. In Abb. 23 erhält man für ACN eine scheinbar bessere Auftrennung. Man erhält deutlich schmalere Signale für das Trimerensextett. Die Peaks 3 und 4 dieses Sextetts sind im Vergleich zum Ethanol besser getrennt. Man erhält für ACN jedoch keine Basislinientrennung. In dem Puffersystem aus 240 mM Natriumborat mit 10 Vol.% EtOH erhält man hingegen annähernd basisliniengetrennte Signale des Trimerensextetts. Die schlechtere Auftrennung der Signale 3 und 4 im Puffer/EtOH-System lässt sich durch die 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 10% H2O A U Migrationszeit [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 10% ACN A U 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 10% Iso A U 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00 0,02 320 mM Borat 10% EtOH A U N1 N3 N1 N2 N1 N1 N2 N2 N2 Ergebnisse und Diskussion 45 Peakverbreiterung aufgrund der verlängerten Migrationszeiten erklären. 80 mM Borat 2 3 4 5 6 7 H2O ACN ISO EtOH Modifier [10%v/v] M ig ra tio ns ze it [m in ] N1 N2 N3 160 mM Borat 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 H2O ACN ISO EtOH Modifier [10%v/v] M ig ra tio ns ze it [m in ] N1 N2 N3 240 mM Borat 4 9 14 19 24 29 34 H2O ACN ISO EtOH Modifier [10%v/v] M ig ra tio ns ze it [m in ] N1 N2 N3 320 mM Borat 8 13 18 23 28 33 38 43 H2O ACN ISO EtOH Modifier [10%v/v] M ig ra tio ns ze it [m in ] N1 N2 Abb. 25: Änderungen der Migrationszeiten der Oligomere N1-N3 in Abhängigkeit vom zugesetzten Modifier Die Verwendung hochkonzentrierter Puffer führt in der Regel zu hohen Stromstärken und damit zu einer Erwärmung des Elektrolytsystems, der sogenannten Joule-Erwärmung. Aufgrund der sich ausbildenden Temperatur- und Viskositätsgradienten nimmt die Bandenverbreiterung zu und die Bodenzahl N entsprechend ab [Abschnitt 2.2.3]. Dies führt insgesamt zu einer Abnahme der Trenneffizienz [24,25]. Durch den Einsatz von Kapillaren mit geringen Innendurchmessern kann dieses Problem, wie im vorangegangenen Abschnitt beschrieben, überwunden werden. Man muss jedoch bedenken, dass sich hierdurch auch die Dimensionen der Detektorzelle verringern. Dies führt unweigerlich zu einer Verringerung der Nachweisempfindlichkeit der UV-Detektion. Für stark UV-absorbierende Substanzen stellt dies keinen nennenswerten Nachteil dar. Bei schwächer absorbierenden Proben kann es jedoch dazu führen, dass sie unterhalb der Nachweisgrenze des Detektors liegen und somit nicht detektiert werden können. Ergebnisse und Diskussion 46 Betrachtet man nun die während der Trennung auftretenden Stromstärken und deren Änderungen in Abhängigkeit vom verwendeten Modifier (Abb. 26), stellt man fest, dass für Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 25 µm die Änderungen in den Stromstärken im Bereich von 5 µA liegen. Da die Stromstärken nur im Bereich von 10 – 15 µA liegen, sind die Absolutwerte sowie deren Änderungen für die Trenneffizienz nur von untergeordneter Rolle. Die bei diesen Stromstärken auftretende Joule-Erwärmung kann vernachlässigt werden. Stromstärke 0 2 4 6 8 10 12 14 16 H2O ACN ISO EtOH Modifier [10% v/v] St ro m st är ke [µ A ] B80 B160 B240 B320 Abb. 26: Änderung der Stromstärken in Abhängigkeit vom Modifier Werden die Messungen in einer Kapillare mit 50 µm Innendurchmesser durchgeführt, liegen die Stromstärken im Bereich von 120 – 180 µA. Diese hohen Stromstärken und die damit verbundene Erwärmung des Systems können in Bezug auf die Trenneffizienz nicht mehr vernachlässigt werden. In Abb. 27 sind die Stromstärken in Abhängigkeit vom Modifier für Kapillaren mit 25 µm und 50 µm Innendurchmesser dargestellt. Man erkennt, dass z.B. die Zugabe von 10 % Ethanol zum Puffer die auftretende Stromstärke um 50 µA oder 28% senkt. Dies ist ein beträchtlicher Wert, der die Erwärmung und die dadurch verursachten negativen Auswirkungen auf die Trennleistung deutlich verringert. Hierdurch erhält man im Allgemeinen bessere Trennungen. Eine der Ursachen dieses Effektes liegt in der Verringerung der Dielektrizitätskonstante εr des modifizierten Puffers. Dies führt zu einer verringerten elektrischen Feldstärke und somit zu einer Verringerung der Ergebnisse und Diskussion 47 erzeugten elektrischen Leistung mit den im Abschnitt 2.2.3 beschriebenen Wirkungen auf die Trenneffizienz. 320 mM Borat 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 H2O ACN ISO EtOH Modifier [10% v/v] S tro m st är ke [µ A ] ID=50µm ID=25µm Abb. 27: Änderung der Stromstärke in Abhängigkeit vom Modifier für verschiedene Kapillar- innendurchmesser Durch den Zusatz sogenannter EOF-Modifier zum Puffer wird eine annähernd gleiche Trenneffizienz wie bei Verwendung hochkonzentrierter Puffer erreicht. Im Gegensatz zu den hochkonzentrierten Puffern werden bei Verwendung der modifizierten Puffer die auftretende Stromstärke und die damit einhergehende Temperaturerhöhung deutlich verringert. Eine Ober- grenze für die sich ausbildende Stromstärke ist nur gerätetechnisch bestimmt. Die meisten kommerziell erhältlichen CE-Geräte lassen maximale Stromstärken von 250 – 300 µA zu. Die maximale Temperatur innerhalb der Kapillare muss unterhalb der Siedetemperatur der Pufferlösung liegen, da bei beginnender Gasentwicklung die sich in der Kapillare ausbildenden Gasblasen zu einem Zusammenbruch der Feldstärke und damit zu einem Abbruch der Messung führen. In diesem Abschnitt konnte gezeigt werden, dass man durch die Zugabe organischer Modifier zum Puffer ein optimiertes Trennsystem erhält, das auch in Kapillaren mit größeren Innendurchmessern den Einsatz hochkonzentrierter Puffer bei höheren Spannungen zulässt. Als Modifier haben sich vor allem niedermolekulare Alkohole bewährt. Ergebnisse und Diskussion 48 3.1.3 Abhängigkeit der Oligomerentrennung vom Volumenanteil des eingesetzten Modifiers Im vorigen Abschnitt konnte gezeigt werden, dass die Zugabe organischer Modifier zum Puffer einen positiven Einfluss auf elektrophoretische Trennungen hat. Um die Abhängigkeit der Trenneffizienz vom Volumenanteil des zugesetzten Modifiers zu untersuchen, wurden dem Puffer unterschiedliche Anteile an Isopropanol zugesetzt. Es wurde ein 160 mM Natriumboratpuffer mit jeweils 10, 20 und 30% v/v Isopropanol als organi- schen EOF-Modifier untersucht. Die Trennungen erfolgten in einer Quarzglaskapillare mit einer Länge von 32 cm und einem Innendurchmesser von 50 µm bei einer Spannung von 15 kV. Die Trenneffizienz wurde anhand der Trennung von PSS 1.1k untersucht. Als EOF-Marker wurde Tetrahydrofuran (THF) verwendet. In Abbildung 28 sind die Elektropherogramme für den 160 mM Natriumboratpuffer mit verschiedenen Volumenanteilen an Isopropanol dargestellt. Man erkennt, dass mit zunehmendem Isopropanolanteil die Auftrennung der Oligomere deutlich besser wird. Parallel hierzu nimmt die Trenndauer für das vorliegende Experiment um den Faktor 4 zu. Für den reinen Puffer, Kurve A in Abbildung 28, erfolgt die Trennung innerhalb von 4 Minuten. Es werden jedoch nur die Oligomere N1 - N3 basisliniengetrennt. Mit zunehmendem Volumenanteil an Isopropanol wird auch die Auftrennung der höheren Oligomere deutlich besser. So erkennt man in Kurve B (10% v/v) bei 3,8 min zusätzlich den Oligomerpeak für das Pentamere N5. Ab einem Volumenanteil von 20% v/v (Kurve C) erfolgt eine zusätzliche Isomerenaufspaltung für die Oligomere N1 - N3. Für 30% v/v Isopropanol im Puffer (Kurve D) werden die Isomeren für N3 teilweise basisliniengetrennt. Für das Tetramere N4 werden ebenfalls zusätzliche Isomerenpeaks sichtbar. Ergebnisse und Diskussion 49 Abb. 28: Elektropherogramme von PSS 1.1k in Abhängigkeit vom Volumenanteil an Isopropanol. Kapillare: 25/32 cm L x 50 µm ID; Puffer: 160 mM Borat ph 9; U: 15 kV; Inj: 3s x 0,5 psi; c PSS1.1k: 0,2 g/l In Abb. 29 sind die Migrationszeiten des EOF sowie der Oligomere N1 – N3 in Abhängigkeit vom Isopropanolanteil dargestellt. Da das Oligomer N3 ab einem Volumenanteil von 20 % in Isomere aufspaltet, wurde zur Bestimmung der Migrationszeit das Peakmaximum des Hauptpeaks ausgewertet. Migrationszeit 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 0% 10% 20% 30% Isopropanol [Vol.%] M ig ra tio ns ze it [m in ] EOF N1 N2 N3 Abb. 29: Änderung der Migrationszeiten in Abhängigkeit vom Volumenanteil an Isopropanol 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,0 0,5 1,0 1,5 0% A U Migrationszeit [min] 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 10% A U 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,0 0,5 1,0 1,5 20% A U 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0,0 0,5 1,0 1,5 160 mM Borat 30% A U N1 N2 N3 N4 N1 N2 N4 N3 N1 N2 N3 N4 N1 N2 N3 N4 C D B A N5 Ergebnisse und Diskussion 50 Die Zunahme der Migrationszeiten ist auf eine Abnahme der elektrischen Feldstärke innerhalb des Systems zurückzuführen. Durch Zugabe des Modifiers ändert sich die Dielektrizitätskonstante εr des Systems. Dies führt zu einer Änderung der elektrischen Feldstärke. Diese Änderung der Feldstärke kann durch die Änderung der während der Trennung auftretenden Stromstärken verdeutlicht werden. Mit zunehmendem Volumenanteil an Isopropanol verringert sich aufgrund der Abnahme der Feldstärke die Stromstärke (Abb. 30). Diese beiden Effekte wirken sich positiv auf die Trenneffizienz aus. Durch Erniedrigung der Feldstärke erhöht sich die Verweildauer in der Kapillare, während durch die Verringerung der sich ausbildenden Stromstärke die Joule-Erwärmung reduziert wird. Man erhält folglich deutlich bessere Trennungen. Migrationszeit vs Stromstärke 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0% 10% 20% 30% Isopropanol [Vol.%] M ig ra tio ns ze it [m in ] 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 St ro m st är ke [1 0-3 µ A] EOF I Abb. 30: Änderungen der Migrationszeit und der Stromstärke in Abhängig- keit vom Volumenanteil an Isopropanol Ergebnisse und Diskussion 51 3.2 Methodenentwicklung zur Trennung und Detektion UV-trans- parenter Polyelektrolyte Im folgenden Abschnitt sollen unterschiedliche Detektionssysteme auf ihre Anwendbarkeit für die CE getestet werden. Viele industriell relevante Polymersysteme wie z.B. Polyacrylsäure (PAS), Polymethacrylsäure (PMAS) und Copolymere aus Polyethylenglycol (PEG) und Polyacryl- bzw. Poly- methacrylsäure sind UV-transparent. Der typischerweise eingesetzte UV- Detektor ist hier nur von begrenztem Wert, da die Signale solcher Polymere teilweise unter der Nachweisgrenze des Detektors liegen. Als Alternativen bieten sich die kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion (CCD) und die indirekte UV-Detektion (IUV) an. 3.2.1 Kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion (CCD) In der kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektion wird die Änderung der elektrischen Leitfähigkeit κ beim Durchgang der Analytionen durch die Detektorzelle gemessen. Für ein gutes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis ist es wichtig, dass sich die Leitfähigkeiten des Elektrolyten und der Analytionen deutlich voneinander unterscheiden. Die in der CE verwendeten Borat-, Phosphat- und TRIS-Puffer weisen eine zu große Eigenleitfähigkeit auf. Mögliche Leitfähigkeitsänderungen, die beim Durchtritt der untersuchten UV- transparenten Polyelektrolyte durch den Detektor auftreten, können mit diesen Puffersystemen nicht detektiert werden. In Folge dessen müssen für die elektrophoretische Trennung mit anschließender Leitfähigkeitsdetektion solcher Polyelektrolyte neue Puffersysteme gefunden und getestet werden. Mögliche Alternativen zu den herkömmlichen Puffern können organische Puffersysteme sein, die aus Arginin/Sorbinsäure (AS), Histidin/Sorbinsäure (HS) oder Morpholinoethansulfonsäure/Arginin (MA) bestehen (Abb. 31). Bei der Leitfähigkeitsdetektion von anorganischen Anionen hat sich das Puffersystem aus 15 mM Arginin und 7 mM Sorbinsäure bewährt [38]. In den folgenden Untersuchungen wurden verschiedene organische Puffersysteme auf ihre Trenneffizienz und Detektionsfähigkeit hin getestet. Als Probe wurde das Natriumsalz einer Polyacrylsäure mit einem mittleren Ergebnisse und Diskussion 52 NH2 N H OH O NH2 NH N H N OH O NH2 O N S OH O O Molekulargewicht von 1300 g/mol (PAS1,3k) verwendet. Die Trennungen wurden in einer unbeschichteten Quarzglaskapillare mit einer Gesamtlänge von 31 cm und einem Innendurchmesser von 50 µm bei verschiedenen Spannungen durchgeführt. Arginin, C6H14N4O2: Histidin, C6H9N3O2: MES, C6H13NO4S: Sorbinsäure, C6H8O2: OH O Abb. 31: Struktur- und Summenformeln der verwendeten organischen Puffer In Abb. 32 sind die Elektropherogramme der Probe PAS1,3k für drei verschiedene Puffersysteme gezeigt. Es ist deutlich zu sehen, dass für alle drei Puffer eine Oligomerentrennung erzielt wird. Der Arginin/Sorbinsäure- Puffer (schwarze Kurve, AS12) weist hierbei die beste Trennung bei einem sehr guten Signal-zu-Rauschen-Verhältnis auf. Die Oligomere im Migrationsbereich von 4 – 11 min sind zum Teil basisliniengetrennt. Im Gegensatz zu den beiden anderen Puffern weist das AS-Elektropherogramm Ergebnisse und Diskussion 53 einen zusätzlichen intensiven Peak bei ca. 3 min auf. Auch der Histidin/Sorbinsäure-Puffer (rote Kurve, HS12) liefert eine gute Trennung der Oligomeren. Im Vergleich zum Arginin/Sorbinsäure-Puffer erhält man jedoch keine basisliniengetrennte Signale. Für den Morpholinoethansulfon- säure/Arginin-Puffer (blaue Kurve, MA12) ergibt sich eine deutlich schlechtere Auftrennung gegenüber den beiden anderen Puffern. Für die weiteren Untersuchungen wird der MA-Puffer nicht mehr berücksichtigt. Da sich der pH-Wert des AS-Puffers (pH 9) deutlich von dem des HS-Puffers (pH 5,5) unterscheidet, beide jedoch zu guten bis sehr guten Auftrennungen der einzelnen Oligomeren führen, werden sie im Folgenden näher untersucht. Abb. 32: Oligomerentrennung von PAS1.3k in Abhängigkeit von verschiedenen organischen Puffern AS12: 12 mM Arginin / 6 mM Sorbinsäure (pH 9); HS12: 12 mM Histidin / 6 mM Sorbinsäure (pH 5,5); MA15: 15 mM Arginin / 7,5 mM MES (pH 9) U: 10kV; Inj: 6s x 0,5 psi; T: 23°C 0 2 4 6 8 10 12 14 11,2 11,4 11,6 11,8 MA15 m V Migrationszeit [min] 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 9,90 9,95 10,00 10,05 HS12m V 0 2 4 6 8 10 12 14 11,7 11,8 11,9 AS12m V PAS-Oligomere ? Ergebnisse und Diskussion 54 3.2.1.1 Vergleich der Trenneffizienz verschiedener organischer Puffer- systeme in Abhängigkeit von ihrer Konzentration Die im vorigen Abschnitt verwendeten organischen Puffersysteme aus Arginin/Sorbinsäure (AS) und Histidin/Sorbinsäure (HS) werden in Abhängig- keit von verschiedenen Konzentrationen auf ihre Trenneffizienz hin untersucht und miteinander verglichen. Die verwendeten Pufferkonzentratio- nen sind in Tabelle 2 dargestellt. Arginin [mM] Sorbinsäure [mM] Histidin [mM] pH-Wert AS3 3 1,5 9 AS6 6 3 9 AS12 12 6 9 HS3 1,5 3 5,5 HS6 3 6 5,5 HS12 6 12 5,5 Tab. 2: Zusammensetzung der Puffer Die Trennungen wurden in einer unbeschichteten Quarzglaskapillare mit einer Gesamtlänge von 31 cm und einem Innendurchmesser von 50 µm bei einer angelegten Spannung von 5 kV durchgeführt. Als Probe wurde wiederum das Polyacrylsäure-Na-Salz PAS1,3k verwendet. In den Abb. 33 und 34 sind die Elektropherogramme für die verschiedenen AS- und HS-Puffer dargestellt. Sowohl für die AS-Puffer als auch für die HS- Puffer wird die Auftrennung in die Oligomere mit zunehmender Puffer- konzentration deutlich verbessert. Dies ist wiederum auf die Verringerung der EOF-Geschwindigkeit mit zunehmender Pufferkonzentration zurückzuführen. Ergebnisse und Diskussion 55 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 12,1 12,2 12,3 AS12 m V Migrationszeit [min] 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 7,56 7,65 7,74 AS6 m V 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 4,28 4,32 4,36 4,40 AS3m V Abb. 33: Oligomerenauftrennung in Abhängigkeit von der Pufferkonzentration für das Puffersystem Arginin/Sorbinsäure AS3 (schwarz), AS6 (rot) und AS12 (blau) 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 5,00 5,02 5,04 5,06 HS12 m V Migrationszeit [min] 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 2,15 2,20 2,25 HS6m V 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 4,23 4,32 4,41 HS3 m V Abb. 34: Oligomerenauftrennung in Abhängigkeit von der Pufferkonzentration für das Puffersystem Histidin/Sorbinsäure HS3 (schwarz), HS6 (rot) und HS12 (blau) Ergebnisse und Diskussion 56 Vergleicht man die entsprechenden AS- und HS-Puffer miteinander stellt man fest, dass schon für den AS3-Puffer eine deutliche Oligomerentrennung zu sehen ist. Mit zunehmender Pufferkonzentration wird diese immer besser. Für den AS12-Puffer erhält man sogar eine basisliniengetrennte Oligomerenverteilung. Im Gegensatz hierzu erreicht man bei den HS-Puffern erst für den HS12-Puffer eine Oligomerentrennung, die aber keine basisliniengetrennte Signale aufweist. In Abb. 35 ist, zur besseren Verdeutlichung der unterschiedlichen Trenneffizienzen, der Oligomeren- bereich für die beiden Puffer AS12 und HS12 vergrößert dargestellt 9 12 15 18 21 24 27 30 12,04 12,06 12,08 12,10 12,12 HS12m V Migrationszeit [min] 9 12 15 18 21 24 12,12 12,16 12,20 AS12m V Abb. 35: Vergrößerte Darstellung des PAS1,3k-Oligomerenbereichs für die Puffer AS12 (schwarz) und HS12 (rot) Neben der Basislinientrennung im AS-System erhält man zusätzlich eine feinere Signalaufspaltung. So sind für die Signale bei höheren Migrationszeiten Substrukturen zu erkennen, die für das HS-System nicht nachgewiesen werden können. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um isomere Strukturen. Eine eindeutige Zuordnung ist zur Zeit mit den zur Verfügung stehenden Mitteln nicht möglich. Ergebnisse und Diskussion 57 Nach den erhaltenen Ergebnissen kann gesagt werden, dass die Arginin/Sorbinsäure-Puffer sehr geeignete Systeme für die kontaktlose Leitfähigkeitsdetektion UV-transparenter synthetischer Polyelektrolyte sind. Durch die geringe Eigenleitfähigkeit der organischen Puffer erhält man für Polyacrylsäure- und Polymethacrylsäureproben ausreichende Leitfähigkeits- unterschiede im CCD-Detektor, die zu hohen Signalintensitäten führen. Durch den pH-Wert von 9 sind die Proben nahezu vollständig dissoziiert. Durch die geringe Leitfähigkeit der Puffer werden während der Trennung nur geringe Stromstärken in der Kapillare erzeugt. Die hierbei auftretenden geringen Temperatureffekte und die damit verbundenen Auswirkungen auf die Trennleistung (siehe Abschnitt 2.3.3) können vernachlässigt werden. 3.2.1.2 Verbesserte Oligomerentrennung für PAS1,3k durch konzent- rierte Arginin/Sorbinsäure-Puffer Wie bei der Trennung von Polystyrolsulfonat in Abschnitt 3.1.1 gezeigt wurde, kann auch die Oligomerentrennung von niedermolekularen Polyacrylsäure-Salzen durch Einsatz höher konzentrierter organischer Puffer (Arginin/Sorbinsäure) deutlich verbessert werden. Hierbei muss jedoch beachtet werden, dass bei Erhöhung der Pufferkonzentration die Leitfähigkeit des Puffers ebenfalls steigt. Dies führt zu einer Verringerung des Leitfähigkeitsunterschieds zwischen Puffer und Analytionen. Da die Signalintensität mit dem Leitfähigkeitsunterschied zwischen Puffer und Analytionen korreliert, kann ein zu geringer Leitfähigkeitsunterschied dazu führen, dass die Signale unterhalb der Nachweisgrenze des Detektors liegen. Für den Arginin/Sorbinsäure-Puffer konnten bei Konzentrationen oberhalb von 40mM Arginin und 20 mM Sorbinsäure keine Signale mehr detektiert werden. Folglich können für die Leitfähigkeitsdetektion keine Pufferkonzentrationen wie bei der optimierten Trennung des PSS1,3k in Natriumboratpuffern eingesetzt werden. Die für die folgenden Untersuchungen verwendeten Pufferkonzentrationen sind in Tabelle 3 aufgelistet. Ergebnisse und Diskussion 58 Puffer Arginin [mM] Sorbinsäure [mM] pH-Wert AS6 6 3 9 AS12 12 6 9 AS16 16 8 9 AS24 24 12 9 Tab. 3: Zusammensetzung der AS-Puffer Abb. 36 zeigt die Elektropherogramme der Probe PAS1,3k in den vier verschiedenen AS-Puffern. Man erkennt wie erwartet eine deutlich verbesserte Trennung der einzelnen Oligomere sowie eine zunehmende Feinaufspaltung der Peaks mit zunehmender Pufferkonzentration. Dieses Ergebnis stimmt mit den Erkenntnissen, aus Kapitel 3 überein. Abb. 36: PAS1,3k-Oligomerentrennung in Abhängigkeit von der Pufferkonzentration Kapillare: 60cm L x 75 µm ID, unbeschichtet U: 5 kV; Inj: 5s x 0,3 psi; T: 20°C Bei den bisher durchgeführten Messungen an PAS1,3k mit gering konzentrierten AS-Puffern wurde ein sehr intensiver Peak direkt vor der Oligomerenserie beobachtet (Peak bei 15min für AS6). Dieser Peak wurde 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 9,85 9,90 9,95 AS24 m V Migrationszeit [min] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 7,45 7,50 7,55 7,60 AS16 m V 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 6,45 6,50 6,55 6,60 AS12 m V 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 4,10 4,15 4,20 4,25 AS6 m V PAS-Oligomere PAS-Oligomere PAS-Oligomere PAS-Oligomere Ergebnisse und Diskussion 59 bis jetzt als Systempeak betrachtet. Durch den Einsatz der höher konzentrierten AS-Puffer konnte jedoch gezeigt werden, dass es sich keinesfalls um einen Systempeak handelt. Vielmehr weist dieser Peak eine zweite Oligomerenverteilung auf, die erst bei höheren Pufferkonzentrationen (AS24) aufgetrennt wird. Die chemische Struktur dieser Oligomerenverteilung konnte bis jetzt nicht erklärt werden. 3.2.1.3 Untersuchung verschiedener Polyacrylsäuresalze mit der kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektion Die in den vorigen Abschnitten getesteten organischen Puffersysteme sollen nun auf die Trennung von Polyacrylsäuresalzen unterschiedlicher Molmasse angewendet werden. Es werden Polyacrylsäure-Na-Salz-Standards mit mittleren Molmassen im Bereich von 1.000 g/mol bis ca. 35.000 g/mol eingesetzt. Die Konzentrationen der Standardlösungen betrugen je 0,75 g/l. In Abb. 37 sind die Elektropherogramme von vier verschiedenen PAS- Proben dargestellt. Abb. 37: Elektropherogramme der Proben PAS1,3k (schwarz), PAS8k (rot), PAS18k (grün) und PAS35k (blau) Kapillare: 60 cm L x 75 µm ID, unbeschichtet; Puffer: 16 mM Arginin / 8 mM Sorbinsäure; pH 9; U: 15 kV, Inj: 5s x 0,3 psi; T: 20°C 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 8,76 8,79 8,82 8,85 8,88 8,91 8,94 PAA1,3k PAA8k PAA18k PAA35k m V Migrationszeit [min] PAS8k PAS18k PAS35k PAS1,3k - Oligomere ? Ergebnisse und Diskussion 60 Die Peakmaxima der höhermolekularen Proben liegen im Bereich von 18 min (PAS18k und PAS35k) bis 19 min (PAS8k). Die Proben PAS18k und PAS35k weisen identische Migrationszeiten auf. Eine weitere Auftrennung dieser Proben ist ohne Zusatz eines Gelbildners nicht mehr möglich. Wie in Abschnitt 2.5.1 theoretisch vorhergesagt, befindet man sich hier in einem Molmassenbereich nahezu konstanter Oberflächenladung-zu-Radius- Verhältnisse und damit nahezu konstanter Mobilitäten. Für die Kurven der Proben PAS8k, 18k und 35k erkennt man einen intensiven Peak bei ca. 24 min. Die Migrationszeit lässt darauf schliessen, dass es sich hierbei um ein relativ kleines Molekül handelt. Es konnte bis jetzt nicht eindeutig geklärt werden, ob es sich um das Monomere oder um ein bisher nicht zu identifizierendes weiteres Anion handelt. Um auszuschließen, dass es sich hierbei um einen vom Puffer generierten Peak handelt, wurde eine Messung durchgeführt, bei der eine Arginin/Sorbinsäure-Probe AS37 (37,5 mM Arginin/18,75 mM Sorbinsäure) für 5 s bei einem Druck von 0,3 psi injiziert wurde. In Abb. 38 ist das Elektropherogramm der AS37-Probe dargestellt. Man erkennt, dass die AS37-Probe ein negatives Signal bei ca. 27 min erzeugt. Dieser negative Peak ist auch bei allen anderen Messungen in Abb. 37 zu sehen. Da in der Messung der AS37-Probe kein positives Signal zu erkennen ist, handelt es sich bei den in Abb. 37 auftretenden Signalen bei einer Migrationszeit von 24 min offensichtlich um einen von den PAS-Na- Proben generierten Peak. Für die Probe PAS1,3k erkennt man, dass dieser Peak (23 min) deutlich breiter und intensiver ist als für die höhermolekularen Proben. Im vorigen Abschnitt konnte gezeigt werden, dass dieser breite intensive Peak eine weitere Oligomerenverteilung aufweist, die jedoch erst bei höher konzentrierten Puffern aufgetrennt werden kann. Die Intensität des bei PAS1,3k auftretenden Peaks lässt darauf schliessen, dass es hier zu einer Überlagerung des unbekannten Probenpeaks mit der zusätzlichen Oligomerenverteilung kommt. In Abb 6, Abschnitt 2.5.1, ist der Verlauf der elektrophoretischen Mobilität von Polyionen in Abhängigkeit von der Anzahl an Wiederholungseinheiten dargestellt. Man erkennt, dass im Bereich der Stäbchenkonformation die elektrophoretische Mobilität linear mit der Anzahl an Wiederholungseinheiten zunimmt, bis sie ein Maximum durchläuft, um danach einen konstanten Wert Ergebnisse und Diskussion 61 anzunehmen. Mit den Messungen in Abb. 37 konnte dieser theoretische Verlauf auch für Polyacrylsäuren experimentell nachgewiesen werden. Für die hier untersuchten Polyacrylsäuresalze liegt der Konversionspunkt der elektrophoretischen Mobilität im Bereich von ca. 2000 g/mol. Minutes 0 10 20 30 40 50 60 V ol ts 0.85 0.86 0.87 0.88 Migrationszeit [min]Minutes 0 10 20 30 40 50 60 V ol ts 0.85 0.86 0.87 0.88 Minutes 0 10 20 30 40 50 60 V ol ts 0.85 0.86 0.87 0.88 Migrationszeit [min] Abb. 38: Elektropherogramm der Probe AS37(37,5 mM Arginin/18,75 mM Sorbinsäure) Kapillare: 60 cm L x 75 µm ID, unbeschichtet; Puffer: 16 mM Arginin / 8 mM Sorbinsäure; pH 9; U: 15 kV, Inj: 5s x 0,3 psi; T: 20°C 3.2.2 Indirekte UV-Detektion (IUV) Neben der im vorigen Abschnitt entwickelten Leitfähigkeitsdetektion stellt die indirekte UV-Detektion eine weitere mögliche Methode zur Detektion UV- transparenter Polyelektrolyte dar. Bei der IUV wird dem Puffersystem ein UV- absorbierendes Co-Ion zugegeben. Die Verdrängung des Co-Ions durch die Analytionen macht sich im Detektor durch eine Abnahme der Extinktion und damit verbunden in einem negativen Signal bemerkbar. Ziel dieser Arbeit war es, Puffersysteme zu finden und zu testen, die eine gute Trennung für PAS und PMAS aufweisen und dabei eine hohe Detektionsempfindlichkeit besitzen. Es hat sich herausgestellt, dass sich die für die Leitfähigkeitsdetektion entwickelten organischen Puffersysteme bestehend aus Arginin/Sorbinsäure oder Histidin/Sorbinsäure ebenfalls für die indirekte UV-Detektion eignen. Die besten Signalintensitäten wurden bei einer Wellenlänge von 254 nm erreicht. Ergebnisse und Diskussion 62 Um die organischen Puffersysteme hinsichtlich ihrer Eignung als Elektrolyte für die indirekte UV-Detektion zu testen, wurde die Probe PAS1,3k jeweils mit dem HS12- und dem AS12-Puffer gemessen. In Abb. 39 ist das Elektro- pherogramm der Probe PAS1,3k für den HS12-Puffer dargestellt. Die Oligomerenverteilung weist scharfe und intensive Signale auf. Die Signale sind jedoch nicht basisliniengetrennt. Minutes 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 A U -0.0020 -0.0015 -0.0010 -0.0005 Migrationszeit [min]Minutes 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 A U -0.0020 -0.0015 -0.0010 -0.0005 Minutes 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 A U -0.0020 -0.0015 -0.0010 -0.0005 Migrationszeit [min] Abb. 39: Oligomerenverteilung der Probe PAS1,3k in HS12 Puffer: 12 mM Histidin/ 6 mM Sorbinsäure; pH 5,5 Kapillare: 31 cm L x 50 µm ID, unbeschichtet U: 10kV; Inj: 10s x 0,5psi; T: 23°C In Abb. 40 ist der Oligomerenbereich der Probe für den AS12-Puffer dargestellt. Die Oligomerenverteilung weist ebenfalls scharfe und intensive Peaks auf. Obwohl die Trennung im AS-Puffersystem deutlich schneller abläuft als im vergleichbaren HS-Puffersystem, erhält man eine deutlich bessere Auftrennung mit teilweise basisliniengetrennten Signalen. Der Oligomerenbereich wird im AS-Puffer innerhalb von 9 min, im HS-Puffer in 14 min aufgetrennt. Ergebnisse und Diskussion 63 Minutes 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A U -0.002 -0.001 0.000 0.001 Migrationszeit [min]Minutes 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 A U -0.002 -0.001 0.000 0.001 Migra