Mikrobieller Abbau von Siliconölen, Siloxanen und Silanolen ? Von dem Fachbereich der Biologie der Technischen Hochschule Darmstadt zur Erlangung des akademischen Grades eines Doctor rerum naturalium genehmigte Dissertation von Diplom-Biologin Miryam Fischer-Reinhard aus Stade Berichterstatter: Prof. Dr. J. Heider Mitberichterstatterin: Prof. Dr. F. Pfeifer Tag der Einreichung: 23.07.2007 Tag der mündlichen Prüfung: 31.08.2007 Darmstadt 2007 D 17 Inhaltsverzeichnis i I Zusammenfassung 1 II Einleitung 3 1. Eigenschaften und Bedeutung des Elementes Silicium 3 1.1 Nomenklatur der Verbindungen des Elementes Silicium 3 1.2 Beispiele für die biologische Bedeutung des Elementes Silicium 4 1.3 Bedeutung des Elementes Silicium für die Industrie 5 1.3.1 Bedeutung des Elementes Silicium in der vorindustriellen Zeit 5 1.3.2 Forschungsgeschichte des Elementes Silicium bis hin zum Silicon 5 1.3.3 Verwendung von Silicium in der Industrie 6 2 Silicone 7 2.1 Herstellung und Verwendung von Siliconen 7 2.2 Silicone und ihre Bedeutung für die Umwelt 10 3 Mikrobieller Abbau von Siliconen 10 3.1 Aerober Abbau von Siliconen 12 3.2 Anaerober Abbau von Siliconen 13 4 Zielsetzung der Dissertation 13 III Material und Methoden 14 1 Verwendete Materialien 14 1.1 Chemikalien und Gase 14 1.2 Biochemikalien 14 1.3 Isotopenmarkierte Verbindung 14 1.4 Säulen-Chromatographiematerial 14 2 Verwendete Bakterien 15 3 Medien und Puffer 15 3.1 Medien und Puffer 15 3.1.1 Grundmedium I 16 3.1.2 Grundmedium II 18 3.1.3 LB-(Luria-Bertani)-Medium und -Agar 19 3.1.4 Herstellung der DMSD-Stammlösung 19 4 Kultivierung und Charakterisierung von Bakterien 20 4.1 Kultivierung von anaeroben Bakterien 20 4.2 Anreicherungskulturen 20 Inhaltsverzeichnis ii 4.3 Isolierung von Reinkulturen 22 4.4 Anzucht mit 14C-markiertem DMSD als Substrat 23 4.4.1 Anaerobe Anzucht von Paracoccus sp. IO-1 und Ochrobactrum sp. Si-1 mit 14C-DMSD als Substrat 23 4.4.2 Aerobe Anzucht von Arthrobacter sp. ATCC 700240 24 4.4.3 Probeentnahme von Kulturen, die mit 14C-DMSD als Substrat angezogen wurden 24 4.5 Anzucht von Paracoccus sp. IO-1, Ochrobactrum sp. Si-1 und Arthrobacter sp. ATCC 700240 mit nicht markiertem DMSD 24 4.6 Anzuchten im 5 l-Fermenter 25 4.7 Morphologische Charakterisierung 27 4.7.1 Lichtmikroskopie 27 4.7.2 Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie 27 4.8 Physiologische Charakterisierung 28 4.8.1 Substratspektrum 28 4.8.2 Abbaufähigkeiten und Eigenschaften 28 4.9 Wirkung verschiedener Substanzen auf das Wachstum 29 4.9.1 Minimale Hemmkonzentration verschiedener Substanzen 29 4.9.2 Toxizität verschiedener Substanzen 29 4.10 Messung des Bakterienwachstums 30 4.10.1 Photometrische Kontrolle des Bakterienwachstums 30 4.10.2 Nachweis von Nitrat und Nitrit 30 5 Isolierung von 14C-DMSD abbauenden Mikroorganismen unter verschiedenen Bedingungen 31 5.1 Herstellung der Medien 31 5.1.1 Medium für die Anreicherung von denitrifizierenden Mikroorganismen 31 5.1.2 Medium für die Anreicherung von sulfatreduzierenden Mikroorganismen 32 5.1.3 Medium für die Anreicherung von Methanogenen/Acetogenen 33 5.1.4 Medium für die Anreicherung aerober Mikroorganismen 34 5.2 Kulturansätze des Screening-Versuches 35 6 Herstellen von Zellextrakten und Stammkulturhaltung 39 6.1 Zellernte 39 6.2 Zellaufschluß 40 6.3 Stammkulturhaltung 40 Inhaltsverzeichnis iii 7 Biochemische Methoden 41 7.1 Proteinbestimmung nach Bradford 41 7.2 Fällungen 41 7.2.1 Ammoniumsulfat-Fällung 41 7.2.2 Trichloressigsäure-Fällung (TCA) 42 7.2.3 Trichloressigsäure-Fällung (TCA)/Aceton-Fällung vor isolelektrischer Fokussierung 42 7.3 Elektrophoretische Methoden 42 7.3.1 Eindimensionale Polyacrylamid-(1 - D)-Gelelektrophorese 42 7.3.2 Zweidimensionale Polyacrylamid-(2 - D)-Gelelektrophorese 45 7.3.3 Färbung von Polyacylamidgelen 47 7.4 Agarose-Gelelektrophorese 49 7.5 Identifizierung induzierter Proteine mittels MALDI-TOF-MS 50 7.6 Reinigung der Isobutyrat-CoA Ligase 50 7.6.1 DEAE-Sepharose Fast Flow-Säule 50 7.6.2 Reactive-Green-Tropfsäule 51 7.7 Enzymtest zur Bestimmung der potentiellen Isobutyrat-CoA Ligase Aktivität 51 8 Analytische Methoden 52 8.1 Hochleistungflüssigkeitschromatographie (HPLC) 52 8.2 Nachweis von 14C-CO2 mittels Bariumchlorid-Fällung 53 8.3 Radioaktivitätsbestimmung 54 8.4 NMR (nuclear magnetic resonance)-Analyse 55 9 Molekularbiologische Methoden 55 9.1 Isolierung chromosomaler DNA 55 9.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 56 9.3 Reinigung, Konzentrierung und Umpufferung von DNA über ein PEQLAB Kit 58 9.4 Sequenzierung und Sequenzanalyse 58 9.4.1 16S rDNA 59 9.4.2 Gencluster der codierenden Gene des Chinohämoproteins 59 IV Ergebnisse 60 1 Isolierung möglicher Silanol- und Siloxan-abbauender Mikroorganismen 60 1.1 Paracoccus sp. IO-1 60 Inhaltsverzeichnis iv 1.2 Ochrobactrum sp. Si-1 60 1.3 Isolierung einer Silanol-abbauenden Reinkultur aus der Anreicherungskultur P-C 64 2 Charakterisierung von Bakterien bei Wachstumsversuchen mit Silanolen oder Siloxanen 66 2.1 Phänotypveränderung bei Wachstumsversuchen auf wasserunlöslichen Siloxanen 66 2.2 Morphologische Charakterisierung: transmissions- und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen 67 2.3 Wachstumsversuche mit monomeren Siliconöl-Modellverbindungen als Substrate - Substratspektrum 69 2.4 NaHCO3-Abhängigkeit bei Wachstumsversuchen von Paracoccus sp. IO-1 und Ochrobactrum sp. Si-1 auf DMSD 70 2.5 Acetat-Abhängigkeit bei Wachstumsversuchen von Paracoccus sp. IO-1 und Ochrobactrum sp. Si-1 auf DMSD 72 2.6 Wachstumsversuche mit D5 als Substrat 75 2.6.1 Wachstumsversuche im Fermenter 75 2.6.2 Proteinmustervergleich 77 2.7 Toxizität und minimale Hemmkonzentration von Silanolen 79 2.7.1 Toxische Wirkung von DMSD und M3 auf das Wachstum von Paracoccus sp. IO-1 79 2.7.2 Minimale Hemmkonzentration (MHK) von DMSD und M3 für Paracoccus sp. IO-1 80 2.8 Wachstumsversuche von Bakterien mit Dimethylsilandiol (DMSD) als Substrat 82 2.8.1 Wachstumsversuche mit nicht markiertem DMSD 82 2.8.2 Abbauversuche mit radioaktiv markiertem DMSD 87 3 Untersuchung des mikrobiellen Abbaus von 14C-DMSD unter verschiedenen Bedingungen 93 4 Mikrobiologische Charakterisierung von Paracoccus sp. IO-1, Paracoccus denitrificans PD 1222 und Ochrobactrum sp. Si-1 94 4.1 Abbaufähigkeiten und metabolische Eigenschaften 94 4.2 Wachstum von Paracoccus sp. IO-1 im 5 l-Fermenter mit Isobutyrat als Substrat 95 5 Proteinmustervergleich von Paracoccus sp. IO-1 beim Wachstum auf verschiedenen Substraten 98 6 Identifizierung von induzierten Proteinen bei Wachstumsversuchen auf dem Siloxan D5 100 Inhaltsverzeichnis v 6.1 Isolierung und Identifizierung eines induzierten Spots aus einem 2-D-Gel 100 6.2 Amplifizierung des Genclusters der codierenden Gene des Chinohämoproteins 103 7 Isolierung und Charakterisierung einer potentiellen Isobutyrat-CoA Ligase 105 7.1 Identifikation und Anreicherung einer potentiellen Isobutyrat-CoA Ligase 106 7.2 Isobutyrat-CoA Ligase vs. Acetat-CoA Ligase 108 V Diskussion 110 1 Isolierung und Charakterisierung von Mikroorganismen in Abhängigkeit von Silanolen (DMSD und M3) und dem Siloxan D5 110 1.1 Paracoccus sp. IO-1 110 1.2 Ochrobactrum sp. Si-1 110 2 Mögliche Abbauwege von Siliconölen, Silanolen und Siloxanen 111 3 Veränderung des Phänotyps von Paracoccus sp. IO-1 beim Wachstum mit dem Siloxan D5 113 4 Induzierte Proteine beim Wachstum mit D5 114 4.1 Ein Chinohämoprotein als Siloxan-induziertes Protein 114 5 Korrelation des Silanol-Stoffwechsels mit der Supplementation von NaHCO3 und Acetat 119 6 14C-DMSD wird durch Paracoccus sp. IO-1, Ochrobactrum sp. Si-1 und Arthrobacter sp. ATCC 700240 nicht abgebaut 120 7 Screening nach Silanol-abbauenden Mikroorganismen mit 14C-DMSD als Substrat 122 8 Isobutyrat-CoA Ligase – das erste Enzym des anaeroben Isobutyrat- Abbaus 123 Literaturverzeichnis 124 Anhang 130 Abkürzungsverzeichnis 137 Danksagung 139 Summary I Summary Silicon oils, silanols and siloxanes are gaining more and more importance in everyday life and in technology. Via waste water they also reach the natural habitats of microorganisms. The microbial degradation of silicon oils is up to now only very little understood. Therefore the aim of this work was to search for microorganisms, which degrade silicon oils, silanols and siloxanes under anaerobic or aerobic conditions. 1. At the onset of this work first results suggested, that Paracoccus sp. IO-1 was able to reduce nitrate depending on the availability of dimethylsilandiol (DMSD). Additionally it could be shown, that strain IO-1 consumed nitrate depending on the presence of silicon oils, silanols or siloxanes. Furthermore, a pure culture was isolated from an enrichment culture under denitrifying conditions with trimethylsilanol (M3) as substrate. It also reduced nitrate depending on the presence of silanol and siloxane and could be identified as Ochrobactrum sp. Si-1. 2. The silanol and siloxane depending consumption of nitrate of Paracoccus sp. IO-1 and Ochrobactrum sp. Si-1 could be enhanced by adding NaHCO3- (minimum concentration 10 mM) and acetate in 0,2 mM-portions. 3. In cell cultures with non water soluble substrates, for instance the siloxane decamethylcyclopentasiloxane (D5), Paracoccus sp. IO-1 generates hydrophobic surface proteins or surface structures which attach the cell to the substrate. Grown on water soluble substrates as acetate, isobutyrate or butyrate, the bacteria are suspended in the water phase. 4. The protein pattern of Paracoccus sp. IO-1 grown on different substrates (acetate, isobutyrate, butyrate or D5) were compared to gain more information about induced proteins of the siloxane dependend growth. Some siloxane Summary specific induced proteins could be found. Among these, a β-subunit of a quinohemoprotein could be identified. 5. The degradation should be proven using radioactivly marked DMSD and measuring the decrease of the 14C-DMSD concentration and the production of 14C-CO2 from the oxidation of the methyl groups. Neither the degradation of DMSD nor the production of CO2 by Paracoccus sp. IO-1, Ochrobactrum sp. Si-1 or Arthrobacter sp. strain ATCC 700240 (which is known in the literature as a DMSD degrading strain) could be ascertained. 6. In an extensive screening for DMSD degrading microorganisms, numerous enrichment cultures with 14C-DMSD as substrate were prepared under different physiological conditions (anaerobic under denitrifying, sulphate reducing and methanogenic/acetogenic as well as aerobic conditions). In addition, the cometabolic degradation of DMSD and DMSO, acetone/2- propanole or yeast extract was studied. Despite the comprehensive approach, a microbial degradation of 14C-DMSD could not be demonstrated. 7. The isobutyrate-CoA ligase could be enriched from cells of Paracoccus sp. IO-1 grown on isobutyrate. This ligase is potentially the first enzyme of the still unknown way of isobutyrate degradation by Paracoccus sp. IO-1. Zusammenfassung 1 I Zusammenfassung Siliconöle, Silanole und Siloxane gewinnen immer größere Bedeutung in Alltag und Technik und gelangen über das Abwasser auch an die natürlichen Standorte von Mikroorganismen. Der mikrobielle Abbau von Siliconölen ist bisher aber nur sehr wenig untersucht. Daher sollte in dieser Arbeit gezielt nach Mikroorganismen gesucht werden, die unter anaeroben oder aeroben Bedingungen Siliconöle, Silanole und Siloxane abbauen. 1. Zu Beginn dieser Arbeit gab es erste Hinweise, dass Paracoccus sp. IO-1 unter denitrifizierenden Bedingungen Dimethylsilandiol (DMSD)-abhängig Nitrat reduziert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Stamm IO-1 des weiteren Siliconöl-, Silanol- und Siloxan-abhängig Nitrat verbrauchte. Weiterhin wurde aus einer Anreicherungskultur unter denitrifizierenden Bedingungen mit Trimethylsilanol (M3) als Substrat eine Reinkultur isoliert, die als Ochrobactrum sp. Si-1 identifiziert wurde und die ebenfalls Silanol- und Siloxan-abhängig Nitrat reduzierte. 2. Der Silanol- und Siloxan-abhängige Nitratverbrauch durch Paracoccus sp. IO-1 und Ochrobactrum sp. Si-1 wurde durch Zugabe von NaHCO3- (mindestens 10 mM) und 0,2 mM-Portionen Acetat gesteigert. 3. Bei Anzuchten mit wasserunlöslichen Substraten wie dem Siloxan Decamethylcyclopentasiloxan (D5) bildet Paracoccus sp. IO-1 hydrophobe Oberflächenproteine oder -strukturen aus, die für die Anheftung an das Substrat sorgen. Hingegen sind die Bakterien beim Wachstum auf wasserlöslichen Substraten wie Acetat, Isobutyrat oder Butyrat in der wässrigen Phase suspendiert. 4. Proteinmuster von Paracoccus sp. IO-1 beim Wachstum mit verschiedenen Substraten (Acetat, Isobutyrat, Butyrat und D5) wurden verglichen, um weitere Informationen über induzierte Proteine beim Siloxan-abhängigen Zusammenfassung 2 Wachstum zu erhalten. Hierbei wurden einige Siloxan-spezifisch induzierte Proteine gefunden, von denen eines als β-Untereinheit eines Chinohämoproteins identifiziert wurde. 5. Mittels radioaktiv markiertem DMSD sollte der Abbau über die Abnahme der Konzentration des 14C-DMSD und die Produktion von 14C-CO2 aus der Oxidation der markierten Methylgruppen des DMSD aufgeklärt werden. Dabei wurde jedoch weder ein Abbau des DMSD noch die Produktion von CO2 durch Paracoccus sp. IO-1, Ochrobactrum sp. Si-1 und den in der Literatur als DMSD-abbauenden Arthrobacter sp. Stamm ATCC 700240 festgestellt. 6. In einem umfangreichen Screening nach DMSD-abbauenden Mikroorganismen wurden Anreicherungskulturen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen mit 14C-DMSD angezogen (anaerob unter denitrifizierenden, sulfatreduzierenden und methanogenen/acetogenen sowie aeroben Bedingungen). Zusätzlich wurde der cometabolische Abbau von DMSD und DMSO, Aceton/2-Propanol oder Hefeextrakt untersucht. Auch mit diesem umfassenden Screening wurde kein mikrobieller Abbau des 14C-DMSD nachgewiesen. 7. Die Isobutyrat-CoA Ligase wurde aus Extrakten von auf Isobutyrat angezogenen Zellen von Paracoccus sp. IO-1 angereichert. Die Ligase ist das potentielle erste Enzym des noch unbekannten anaeroben Abbaus von Isobutyrat durch Paracoccus sp. IO-1. Einleitung 3 II Einleitung 1 Eigenschaften und Bedeutung des Elementes Silicium Silicium ist mit einem Anteil von 28 % das zweithäufigste Element der Erdkruste (Cotton 1972), es liegt jedoch in der Natur wegen seiner hohen Affinität zum Sauerstoff nur in gebundener Form wie z.B. in Silikaten oder als Siliciumdioxid vor. Silicium ist ein Element der 4. Hauptgruppe und steht im Periodensystem direkt unter dem Kohlenstoff; Silicium ist somit elektropositiver als Kohlenstoff. Die chemischen Eigenschaften des Siliciums entsprechen denen eines Nichtmetalles, wobei die physikalischen Eigenschaften eher auf ein Halbmetall hindeuten (Mortimer 1996). Silicium kann mit den meisten Elementen des Periodensystems eine Bindung eingehen, so dass es anorganische, organische und polymere Verbindungen des Elementes Silicium gibt (Brook 2000). Verbindungen mit direkten Kohlenstoff-Silicium-Bindungen werden Organosilane genannt. 1.1 Nomenklatur der Verbindungen des Elementes Silicium Das Silan SiH4 (Abb. 1 A) ist das einfachste Hydrosilan und bildet die Grundlage für die Nomenklatur der Silicium-Chemie. Derivate des Silans werden wie vergleichbare organische Verbindungen benannt und erhalten den entsprechenden Substituenten als Vorsilbe (Abb. 1 B-D; Lane und Burns 1996). Als Siloxane werden Verbindungen bezeichnet, bei denen die Silicium-Atome über je ein Sauerstoff-Atom miteinander verbunden sind (Abb. 1 E). Hydroxy- Derivate von Silicium-Verbindungen werden Silanole genannt (Abb. 1 F) und zyklische Verbindungen beinhalten „cyclo“ als Prä- oder Infix (Abb. 1 G; Brook 2000). Einleitung 4 Abbildung 1: Silicium-Verbindungen: A Silan, B Disilan, C Methyldichlorsilan, D Phenyltrichlorsilan, E Disiloxan, F Triethylsilanol, G Cyclohexasilan. 1.2 Beispiele für die biologische Bedeutung des Elementes Silicium In der Domäne der Eucarya spielt Silicium eine bedeutende Rolle. Zum Beispiel lagern im Reich der Pflanzen die Schachtelhalme (Equisetum) Silikate in die äußeren Zellwände der Stengel-Epidermis ein (Sitte 1998). Diatomeen (Kieselalgen; Abb. 2 B) bilden aus Kieselsäure (Si(OH)4) innerhalb der äußeren Plasmaschicht zweiteilige Silikatschalen (Sitte 1998). Anhand dieser Exoskelette wird sogar die Taxonomie der Diatomeen aufgestellt (Simpson und Volcani 1981). Aus dem Reich der Tiere bilden Vertreter der Radiolarien (Strahlentierchen; Abb. 2 A) Innenskelette bzw. Vertreter der Porifera (Glasschwämme; Abb. 2 C) Exoskelette aus Kieselsäure (Wehner und Gehring 1995). F HSi H H H Si Si H H HH HH Si O Si HH HH HH SiH2 SiH2 Si H2 Si H2 SiH2 SiH2 Si ClCl CH3 H Si Cl ClCl Si OH C2H5 C2H5 H5C2 A B C D E G Einleitung 5 A B C Abbildung 2: A Radiolaria, B Diatomeen und C Schwämme (aus: Ernst Haeckel, Kunstformen der Natur; Haeckel 1904, Taf. 21, Taf. 4 und Taf. 35). 1.3 Bedeutung des Elementes Silicium für die Industrie 1.3.1 Bedeutung des Elementes Silicium in der vorindustriellen Zeit Schon früh in der Menschheitsgeschichte spielte Silicium in Form von Siliciumdioxid, nämlich als Feuerstein (Abb. 3 A), eine bedeutende Rolle im Leben und Wirtschaften des Menschen. Über Jahrtausende war Feuerstein das meistverwendete Rohmaterial für Werkzeuge und Waffen (Whittaker 1994). Für das Entzünden des lebenswichtigen Feuers war Feuerstein bis in die Neuzeit hinein unentbehrlich (Rochow 1987). Der lateinische Name für Feuersteine und Kieselsteine ist silex, von diesem leitet sich die chemische Bezeichnung des Elementes Silicium ab (Rochow 1987). 1.3.2 Forschungsgeschichte des Elementes Silicium bis hin zum Silicon Das Element Silicium wurde erst im Jahre 1824 von Jöns Jakob Berzelius entdeckt (Rochow 1987). Frederick Stanley Kipping stellte mittels der Grignard-Reaktion (Addition von Organo-Magnesium-Verbindungen; Rochow 1987) verschiedene in der Natur nicht vorkommende Organo-Silicium-Verbindungen her. Durch Hydrolyse von Chlororganylsilanen erhielt er „Große Moleküle“ mit der allgemeinen Formel R2SiO, die er Anfang des 20. Jahrhunderts analog der Ketone als Silicone bezeichnete (Rochow 1987; Brook 2000). Er erkannte jedoch nicht ihre Bedeutung und bezeichnete diese Verbindungen als „leimähnlich“. Kipping Einleitung 6 konnte sich nicht vorstellen, dass die chemischen Eigenschaften der Silicone in der Organischen Chemie von Nutzen sein könnten (Rochow 1987; Brook 2000). Der Durchbruch in der Silicon-Chemie gelang erst den Chemikern Eugene G. Rochow und Richard Müller im Jahr 1941. Sie entwickelten die Müller-Rochow- Synthese zur Herstellung von Siliconen für die industrielle Anwendung (Rochow 1987; Kap. I, 2). 1.3.3 Verwendung von Silicium in der Industrie In Produkten wie Glas, Beton oder Zement sind Silicium-Verbindungen als Hauptbestandteile enthalten (Rochow 1987). Für viele Anwendungen wird jedoch auch elementares Silicium benötigt, das in großen Öfen bei Temperaturen von 3000 °C im 100.000 t-Maßstab gewonnen wird. Hierzu wird reinster, weißer Quarzit mit reinem Kohlenstoff (Koks) vermischt, wobei Silicium in einer Reinheit von 98 % entsteht. Siliciumstahl (Ferrosilicium) hat in der Elektroindustrie eine große Bedeutung für die Herstellung von Transformatoren und Motoren. Speziellen Aluminium- und Magnesiumlegierungen wird Silicium zur Stabilisierung beigemischt. Ultrareines Silicium (99,99 %; Abb. 3 B) wird für die Herstellung von Halbleiter- und Photovoltaikanwendungen eingesetzt, hingegen wird für die Herstellung von Siliconpolymeren (Kap. I, 2) nur zu 98 % reines Silicium benötigt (Rochow 1987; Brook 2000). Einleitung 7 A B Abbildung 3: A Feuerstein (SiO2, Foto: J. Reinhard) und B Polysilicium (ultrareines Silicium; Foto: © WACKER Chemie AG; Verwendung mit Genehmigung vom 10.07.2007). 2 Silicone Jährlich werden durch die so genannte Müller-Rochow-Synthese 2 Millionen Tonnen Silicone hergestellt (Brook 2000). Ihre Beliebtheit ist hauptsächlich auf ihre einzigartigen Eigenschaften wie thermische Stabilität, geringe elektrische Leitfähigkeit und hydrophobe Eigenschaften zurückzuführen (Brook 2000). 2.1 Herstellung und Verwendung von Siliconen Zur Herstellung von Siliconen wird festes Silicium mit einem Überschuss von Chlormethan versetzt und bei ca. 300 °C und mit einem Kupferkatalysator zu Methylchlorsilanen umgesetzt (Abb. 4). Die bei dieser Synthese in unterschiedlichen Mengen hergestellten Methylchlorsilane (Dichlordimethylsilan > Trichlormethylsilan > Trichlorsilan > Dichlormethylsilan > Chlortrimethylsilan > Tetrachlorsilan) werden dann durch Destillation voneinander getrennt (Rochow 1987). Die verschiedenen Methylchlorsilane dienen im Weiteren zur Herstellung von speziellen Silanen, Siloxanen und Siliconverbindungen. Trichlorsilan wird als Ausgangssubstanz für die Herstellung von ultrareinem Silicium verwendet (Rochow 1987; WACKER 2007a). Einleitung 8 Abbildung 4: Die Müller-Rochow-Synthese: Festes Silicium reagiert mit Chlormethan zu Dichlordimethylsilan > Trichlormethylsilan > Trichlorsilan > Dichlormethylsilan > Chlortrimethylsilan > Tetrachlorsilan in unterschiedlichen Mengen. Silicone (Polyorganosiloxane) sind Verbindungen, bei denen Silicium-Atome über Sauerstoff-Atome kettenförmig und/oder netzartig verknüpft sind, während die restlichen Valenzen des Siliciums durch Kohlenwasserstoffreste abgesättigt sind. Silicone ähneln in ihrer Struktur organisch modifiziertem Quarz (WACKER 2003a und 2007a). Das Gerüst kann durch die jeweils verwendeten organischen Gruppen verschiedenartig abgewandelt werden. So werden Silicone mit unterschiedlichen Eigenschaften für diverse Anwendungen synthetisiert. Fast alle Siliconprodukte gehören zu einer von drei Rohstoffgruppen: Siliconharze, Siliconkautschuke oder Siliconöle. Silicone findet man heute in fast allen Bereichen des Alltags und der Technik, so dass diese Substanzklasse eine enorme Bedeutung erlangt hat (WACKER 2003a und 2007a). Siliconharze sind unterschiedlich stark vernetzte, dreidimensionale Netzwerke (Abb. 5), die hauptsächlich aus Dichlordimethylsilan- und Trichlormethylsilan- Einheiten mit organischen Seitengruppen hergestellt werden (Rochow 1987; Brook 2000; WACKER 2003b und 2006c); sie sind unter anderem wetter- und hitzebeständig und werden als Bestandteile von Bindemitteln für Farben, Lacke und Beschichtungen verwendet (Rochow 1987; WACKER 2003b und 2006c). Si (s) + 2 CH3Cl (g) (CH3)2SiCl2 > CH3SiCl3 > HSiCl3 > (CH3)HSiCl2 > (CH3)3SiCl > SiCl4 300 °C Cu Einleitung 9 Abbildung 5: Siliconharze: A schwach vernetzt, B stark vernetzt. Siliconkautschuke sind lineare Methylsiliconpolymere (Dimethylpolysiloxan), die meistens durch einen geeigneten Katalysator gezielt vulkanisiert werden (Rochow 1987; Brook 2000; WACKER 2006a und b), dadurch sind sie formbeständig. Weiterhin sind Siliconkautschuke wärme- und dehnbeständig sowie schwer brennbar, weshalb sie auch z.B. in Atemschutzmasken verarbeitet werden. Zusätzlich finden Silikonkautschuke Anwendung als Abdichtungs-, Verklebungs- und Beschichtungsmaterialien; sie sind hochelastisch (WACKER 2006a und b). Siliconöle sind Polymere, die durch Hydrolyse und anschließende Kondensation von Dichlordimethylsilan entstehen (Abb. 6). Die Kettenlänge kann dabei zwischen zwei und weit über 1.000 Silicium-Atome betragen. Sie sind gewöhnlich klare, farblose, pH-neutrale, geruchslose und hydrophobe Flüssigkeiten (Rochow 1987; WACKER 2002 und 2007b). Siliconöle finden Anwendung als Trennmittel (Entformung von Kunststoffteilen, z.B. in der Reifenindustrie), als Gleitmittel (etwa für Kunststofflager, Nähgarn, Weinkorken, Folien), als Dämpfungsmedium, als Hydrauliköl, als flüssiges Dielektrikum (Kühlmittel, Transformatoren), als Hydrophobierungsmittel (Glas, Keramik, Textilien), als Antischaummittel, in kosmetischen Rezepturen (vor allem Hautschutzsalben, Sonnencremes, Haarpflegemittel) und als Pflegemittelzusatz (Auto- und Möbelpolituren, Schuh- und Bodenpflegemittel) (WACKER 2002 und 2007b). OH S O S O S O S O S O S O S O S O S OH R R R R R R RR RRRRR S O S O S O S O S O S O S O S O S OH R R R R R R R O RR OO R R R R R R ROH OH Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si OH H OH OH OH OH OH H OH R O O O O O R O R H OH Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si OH R R O R O R O O O O R R OH Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si OH R R OH R OH R OH OH OH OH R R A B Einleitung 10 Abbildung 6: Zyklisches Siloxan, Siliconöl und monomere Modellsubstrate: A zyklisches Siloxan (Decamethylcyclopentasiloxan); B kettenförmige Siliconöle (Polydimethylsiloxan), C und D monomere Modellsubstrate (C Dimethylsilandiol, D Trimethylsilanol). 2.2 Silicone und ihre Bedeutung für die Umwelt Aufgrund der häufigen Anwendung von Siliconen im Alltag ist es nicht überraschend, dass Silicon-Polymere in alle Bereiche der Umwelt, in die Atmosphäre, den Boden und ins Wasser, gelangen (Gravier et al. 2003). Jedoch stellen die Organosilicone und deren Abbauprodukte sowohl für Landlebewesen und Meeresbewohner als auch für die Umwelt keine Gefahr dar (Gravier et al. 2003). 3 Mikrobieller Abbau von Siliconen Obwohl Mikroorganismen auch an ihren natürlichen Standorten, vor allem im Boden und im Wasser, Zugang zu Organosiloxanen haben, ist bisher nicht viel über ihre Rolle beim Silicon-Abbau bekannt (Gravier et al. 2003). Eine Schwierigkeit besteht darin, dass die Organosiloxane entweder sehr viskos oder leicht flüchtig sind und der Abbau dieser Verbindungen daher nur schwer nachzuweisen ist (Gravier et al. 2003; Lehmann et al. 1998). Si CH3 CH3 OH CH3 OSi O Si O Si O Si O Si CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH Si O Si O Si O Si O Si OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Si CH3 OH OH CH3 A B C D n Einleitung 11 Die am häufigsten vorkommenden Silicon-Polymere, die Polydimethylsiloxane (PDMS; Abb. 7) werden bei der konventionellen Abwasserreinigung nicht entfernt und gelangen so in den Boden und ins Grundwasser. Der Abbau von PDMS soll laut Literatur in zwei Stufen erfolgen (Griessbach und Lehmann 1999): Zunächst wird an Tonmineralien des Bodens in Abhängigkeit vom pH-Wert und dem Grad der Feuchtigkeit eine initiale chemische Hydrolyse und ein Rearrangement der PDMS katalysiert (Abb. 7; Griessbach und Lehmann 1999). Die Depolymerisierung liefert Komponenten mit geringerem Molekulargewicht wie etwa D4 (Octamethylcyclotetrasiloxan) oder D5 (Decamethylcyclopentasiloxan) und Silanole wie die Monomere Dimethylsilandiol und Trimethylsilanol (Gravier et al. 2003). SiCH3 O Si CH3CH3 CH3 CH3 O Si CH3 CH3 CH3 SiCH3 O Si CH3CH3 CH3 CH3 O Si CH3 CH3 CH3 SiOH CH3 CH3 OH SiCH3 CH3 CH3 OH+ Ton Ton xn PDMS DMSD M3 Abbildung 7: Hydrolytischer Abbau von PDMS (Polydimethylsiloxanen) im Boden (M3 Trimethylsilanol, DMSD Dimethylsilandiol; Gravier et al. 2003). Im zweiten Schritt wird Dimethylsilandiol entweder mikrobiell abgebaut (Kap. I, 3.1 und 3.2) oder nach Verdampfen in die Atmosphäre durch Photooxidation, wobei in beiden Fällen dieselben Produkte entstehen, nämlich CO2, SiO2 und H2O (Lehmann et al. 1998 und 2000; Griessbach und Lehmann 1999). Gelangt DMSD durch Diffusion aus dem Boden in die Atmosphäre, wird es dort durch reaktive Sauerstoffspezies wie Hydroxy-Radikale zu den oben genannten Produkten oxidiert (Abb. 8). Nach zehn bis dreißig Tagen ist das Monomer in der Atmosphäre bereits nicht mehr nachweisbar. Einleitung 12 Abbildung 8: Hypothetische Photooxidation der Si-CH3-Gruppen in der Atmosphäre. Die Spaltung der Si-C-Bindung erfolgt durch Hydroxy-Radikale in der oberen Atmosphäre, so dass schließlich SiO2, H2O und CO2 entstehen. 3.1 Aerober Abbau von Siliconen R. Wasserbauer und Z. Zadak berichteten 1990, dass ein Pseudomonas putida- Stamm aerob mit Polydimethylsiloxan (PDMS) als einziger Kohlenstoffquelle wächst (Wasserbauer und Zadak 1990). Beim Wachstum von Pseudomonas putida auf PDMS wurden dabei jedoch keine Abbauprodukte identifiziert; zudem wurde die Reinheit des eingesetzten Siliconöls nicht überprüft. In dieser Veröffentlichung wird auch berichtet, dass hochmolekulare Siliconöle biologisch besser abbaubar seien als niedermolekulare Siliconöle, was schwer nachvollziehbar ist. Als bisher einziger Hinweis auf eine mikrobielle Spaltung der Si-C-Bindung wurde 1996 publiziert, dass 14C-markiertes Dimethylsilandiol (DMSD) durch einige aerobe Mikroorganismen zu 14CO2 umgesetzt wird (Sabourin et al. 1996). Die Umsetzung des DMSD wurde in dieser Publikation bei Arthrobacter sp. Stamm ATCC 700240 und dem Pilz Fusarium oxysporium (Schlechtendahl) cometabolisch mit anderen Substraten nachgewiesen. Beide Mikroorganismen wachsen allerdings nicht auf DMSD als einzigem Substrat. Außerdem sind keine Intermediate des aeroben Abbaus bekannt. Weiterhin ist unklar, ob Dimethylsilandiol zu anorganischem Silikat umgesetzt wurde. · · SiO CH3 CH3 O SiO CH3 CH3 O HO + SiO CH3 H2C O O O OH2 Si - O CH3 O CH2 O O SiO CH3 O O CH2 O SiO CH3 O O CH O +OHO H2O SiO CH3 O OH +HC O OHCO2 SiO2 H2O+ + · · · Einleitung 13 3.2 Anaerober Abbau von Siloxanen Die bisher einzige Arbeit zum anaeroben Abbau von Siloxanen (Grümping et al. 1999) zeigt, dass in Klärschlamm-Proben unter anaeroben Bedingungen 3 % des zyklischen Oligosiloxans Octamethylcyclotetrasiloxan (D4) nach 100 Tagen zu DMSD hydrolysiert wurde. Ein weiterer Abbau des Monomers wurde allerdings nicht beobachtet. Außerdem wurden die verantwortlichen Bakterien nicht identifiziert. 4 Zielsetzung der Dissertation Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Anreicherung und Isolierung von Mikroorganismen, die mit Siliconölen, Siloxanen und Silanolen (niedermolekulare Siliconöle und monomere Modellsubstrate wie Dimethylsilandiol und Trimethylsilanol) als einzigen Kohlenstoffquellen wachsen. Diese Mikroorganismen wurden näher charakterisiert und kritisch auf ihre Abbaufähigkeiten überprüft. Durch Vergleich von auf Siliconölen, Siloxanen, Silanolen und anderen Substraten gewachsenen Zellen sollten dann schließlich die biochemischen Grundlagen des Stoffwechsels aufgeklärt werden. Da sowohl zum anaeroben als auch zum aeroben Abbau von Siliconölen durch Mikroorganismen noch nichts bekannt ist, sollten sich dadurch Hinweise auf den möglichen Abbauweg der Siliconöle ergeben. Material und Methoden 14 III Material und Methoden 1 Verwendete Materialien 1.1 Chemikalien und Gase Die verwendeten Chemikalien wurden, falls nicht anders vermerkt, in der größtmöglichen Reinheit von den Firmen Bio-Rad (München), Difco (Detroit, USA), Fluka (Taufkirchen), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Sigma-Aldrich (Taufkirchen), Alpha Aesar (Karlsruhe) und vds- optilab (Berlin) bezogen. Es wurde Szintillationscocktail von der Firma Roth (Karlsruhe) verwendet. Stickstoff mit 99,99%iger Reinheit wurde vom Sauerstoffwerk Friedrichshafen bezogen. 1.2 Biochemikalien CoA stammte von der Firma Gerbu (Gaiberg). Die übrigen Biochemikalien wurden von den Firmen Roche (Mannheim), GE Healthcare/Amersham Biosciences (Freiburg) und Sigma-Aldrich (Taufkirchen) bezogen. MolTaq- DNA- Polymerase stammte von der Firma Molzym GmbH & Co. KG (Bremen). 1.3 Isotopenmarkierte Verbindung [14C]-DMSD (3,7 MBq x mmol-1) wurde freundlicherweise vom Consortium für elektrochemische Industrie GmbH (München) zur Verfügung gestellt. 1.4 Säulen-Chromatographiematerial Säulen-Chromatographiematerial und -zubehör wurden von der Firma GE Healthcare/ Amersham Bioscience (Freiburg), Merck (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Taufkirchen) und Bio-Rad (München) bezogen. Material und Methoden 15 2 Verwendete Bakterien Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in Tab. 1 aufgeführt. Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme Stamm relevanter Genotyp Referenz Paracoccus sp. Stamm IO-1 Laborstamm, DSMZ-Nr. 17705 (Zorn 2003), * Paracoccus denitrificans Typstamm DSMZ-Nr. 413T (Rainey et al. 1999) Paracoccus sp. Stamm B8B1 DSMZ-Nr. 12584 (Kniemeyer et al. 1999) Paracoccus denitrificans PD 1222 Laborstamm (erhalten von Richardson, D.J. School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, NR4 7TJ, United Kingdom) Ochrobactrum sp. Stamm Si-1 Laborstamm ( im Rahmen dieser Dissertation) Arthrobacter sp. ATCC-Nr. 700240 (Sabourin et al. 1996) *im Rahmen des Patentes wurde Paracoccus sp. IO-1 bei der DSMZ mit der Nummer: DSMZ-Nr. 17705 hinterlegt: Consortium für elektrochemische Industrie GmbH, Fischer, M. und Heider, J. (2007): Verfahren zum anaeroben Abbau von organo-funktionalisierten Silicium-Verbindungen, Silanen und Siloxanen durch Bakterien. Internationale Anmeldung PCT/EP2007/051116 vom 6. Februar 2007. 3 Medien und Puffer 3.1 Medien und Puffer Alle Medien und Lösungen wurden mit Aqua bidest. hergestellt. Kulturmedien und Puffer wurden durch Autoklavieren (25 min bei 120 °C, 1 bar), hitzelabile Lösungen durch Filtration mit Sterilfiltern (Rotilabo®-Spritzenfilter, 0,22 µm, Fa. Roth) sterilisiert. Anaerobe Medien und Supplemente wurden wiederholt mit 99,99%igem Stickstoff begast und anschließend unter Vakuum entgast. Die Zyklen dauerten jeweils 2 min. Hungate-Röhrchen wurden leer begast und das Medium nach dem Autoklavieren steril eingespritzt. Ab einer Menge von 100 ml wurde das Medium unter ständigem Schütteln anaerobisiert, dabei wurden mindestens 10 Zyklen durchlaufen, Volumina von 1 l und 2 l wurden für 20 Zyklen anaerobisiert. Material und Methoden 16 3.1.1 Grundmedium I (phosphatgepuffert, 25fach) Tabelle 2: Grundmedium I Einwaage Endkonzentration im Medium KH2PO4 22,4 g/l 6,6 mM K2HPO4 112,0 g/l 25,7 mM NH4Cl 16,0 g/l 12,0 mM Na2SO4 4,6 g/l 1,3 mM 40 ml des 25fachen Grundmediums wurden mit Aqua bidest. auf 996 ml aufgefüllt, anaerobisiert und autoklaviert. Dazu wurden folgende Komponenten gegeben (Tab. 3-10): Tabelle 3: CaCl2-Stammlösung (0,2 M) Zusammensetzung Einwaage CaCl2 x 2 H2O 29,4 g/l Tabelle 4: MgSO4-Stammlösung (1,6 M) Zusammensetzung Einwaage MgSO4 x 7 H2O 394,2 g/l Material und Methoden 17 Tabelle 5: Vitaminlösung VL7 (1000fach; nach Pfennig 1978) Zusammensetzung Einwaage Cyanocobalamin 100 mg/l Pyridoxamindihydrochlorid 300 mg/l Thiamindichlorid 200 mg/l Ca-D(+)-Pantothenat 100 mg/l 4-Aminobenzoesäure 80 mg/l D(+)-Biotin 20 mg/l Nicotinsäure 200 mg/l Tabelle 6: Spurenelementelösung SL10 (1000fach; nach Widdel et al. 1983, modifiziert) Zusammensetzung Einwaage FeCl2 x 4 H2O 1500 mg/l MnCl2 x 4 H2O 100 mg/l CoCl2 x 6 H2O 190 mg/l Na2MoO4 x 2 H2O 36 mg/l ZnCl2 70 mg/l CuCl2 x 2 H2O 2 mg/l NiCl2 x 6 H2O 24 mg/l H3BO4 6 mg/l 25 %ige HCl 10 ml/l Tabelle 7: Selenit-Wolframat-Lösung Zusammensetzung Einwaage NaOH 400 mg/l Na2SeO3 4 mg/l Na2WO4 x 2H2O 8 mg/l Material und Methoden 18 Tabelle 8: NaNO3- - Stammlösung (2M bzw. 0,2 M) Zusammensetzung Einwaage NaNO3 17 g/100 ml bzw. 1,7 g/100 ml Tabelle 9: Na-Acetat-Stammlösung (10 mM bzw. 100 mM) Zusammensetzung Einwaage Na-Acetat 0,082 g/100 ml bzw. 0,82 g/100 ml Dem autoklavierten und abgekühlten Grundmedium I wurden folgende Supplemente zugegeben: Tabelle 10: Supplemente für das Grundmedium I zugegebene Menge Endkonzentration im Medium CaCl2 (0,2 M) 1 ml/l 0,2 mM MgSO4 (1,6 M) 1 ml/l 1,6 mM Vitaminlösung VL7 (1000fach) 1 ml/l 1fach Spurenelemtelösung SL10 (1000fach) 1 ml/l 1fach Selenit-Wolframat-Lösung (1000fach) 1 ml/l 1-fach NaNO3-Lösung (2 M) 1 ml/l-15 ml/l 2 mM -30 mM 3.1.2 Grundmedium II (bicarbonatgepuffert; nach Rabus 1995, modifiziert) Tabelle 11: Grundmedium II (einfach konzentriert) Einwaage Endkonzentration im Medium KH2PO4 0,5 g/l 3,7 mM NH4Cl 0,3 g/l 5,6 mM MgSO4 x 7 H2O 0,5 g/l 2,0 mM CaCl2 x 2 H2O 0,1 g/l 0,7 mM Das Medium wurde in 100 ml-, 300 ml-, 1 l- oder 2 l-Portionen anaerobisiert und autoklaviert. Anschließend wurden folgende Komponenten (Tab. 5-8 und 12) zugesetzt: Material und Methoden 19 Tabelle 12: NaHCO3-Stammlösung (1 M) Zusammensetzung Einwaage NaHCO3 84 g/l Dem autoklavierten und abgekühlten Grundmedium II wurden folgende Supplemente zugegeben: Tabelle 13: Supplemente für das Grundmedium II Zugegebene Menge Endkonzentration im Medium NaHCO3 (1M) 40 ml/l 40 mM Selenit-Wolframat-Lösung (1000fach) 1 ml/l 1fach Vitaminlösung VL7 (1000fach) 1 ml/l 1fach Spurenelementlösung SL10 (1000fach) 1 ml/l 1fach NaNO3-Lösung (2 M) 1 ml/l – 15 ml/l 2-30 mM Der pH-Wert wurde mit 2 M HCl auf 7,2 eingestellt. 3.1.3 LB-(Luria-Bertani)-Medium und -Agar (Sambrook et al. 1989) Als Vollmedium (Tab. 14) wurde LB-Medium eingesetzt. Zur Verfestigung wurde 1,5 % Agar zugesetzt. Das Medium wurde dann autoklaviert und der noch flüssige Agar in Petrischalen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) gegossen. Tabelle 14: LB-(Luria-Bertani)-Medium (Miller, 1972) Einwaage Trypton 10 g/l NaCl 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l 3.1.4 Herstellung der DMSD-Stammlösung Nicht markiertes DMSD wurde freundlicherweise von der Firma Wacker Chemie AG (München) in Mengen von jeweils ca. 0,1 g zur Verfügung gestellt. Die Reinsubstanz muß bei -20 °C gelagert werden, damit es nicht zur Polymerisation des Monomers kommt. DMSD wurde als Stammlösung von 10 mM in den entsprechenden Volumina von zuvor autoklaviertem und anaerobisiertem Aqua bidest. unter starkem Rühren gelöst. In Wasser gelöstes Material und Methoden 20 DMSD kann nicht autoklaviert, gekühlt oder eingefroren werden und muss dunkel gelagert werden. Radioaktiv markiertes 14C-DMSD (3,7 MBq x mmol-1) wurde von der Firma Wacker Chemie AG (München) als 10 mM-Stammlösung zur Verfügung gestellt. Die lichtmikroskopische Überprüfung der 14C-DMSD-Stammlösung zeigte eine starke Kontamination durch Mikroorganismen. Die Stammlösung wurde deshalb vor Verwendung in eine zuvor autoklavierte und mit Naturkautschukstopfen verschlossene Flasche sterilfiltriert (Rotilabo®-Spritzenfilter, 0,22 µm, Fa. Roth). 4 Kultivierung und Charakterisierung von Bakterien 4.1 Kultivierung von anaeroben Bakterien Anaerobe Flüssigkulturen wurden in mit Naturkautschuk-Stopfen verschlossenen Hungate-Röhrchen und Serumflaschen angezogen. Die Inkubation erfolgte in unterschiedlichen Volumina (10 ml, 100 ml, 300 ml, 1 l und 2 l) bei 30 °C zwei Tage bis zu mehreren Monaten stehend oder liegend auf einem Schüttler, um den größtmöglichen Kontakt der Bakterien zum unlöslichen Substrat zu gewährleisten. Als Medium wurde anaerobisiertes Grundmedium I oder II verwendet (Tab. 2-13). 4.2 Anreicherungskulturen Die Anreicherungskulturen wurden mit den Proben P-1, P-4, P-7, P-14, P-C, P- NA und P-NB (Tab. 15) aus den Werken Burghausen und Nünchritz der Firma Wacker Chemie AG (München) angesetzt. In den übrigen Proben (P-2, P-3 und P5-P13) konnten mikroskopisch keine Mikroorganismen nachgewiesen werden. Die Anzucht erfolgte unter anaeroben Bedingungen mit NO3- als Elektronenakzeptor in Grundmedium II (Tab. 11-13) in Hungate-Röhrchen im 10 ml-Maßstab. Alle Anreicherungskulturen wurden jeweils mit den Substraten Dimethylsilandiol (1 mM), Trimethylsilanol (1 mM) und Decamethylcyclopentasiloxan (1 %) angezogen. Die Inkubation erfolgte liegend auf einem Schüttler bei 30 °C. Zusätzlich wurden Kontrollen angesetzt, die kein Material und Methoden 21 Substrat enthielten. Hatten die Kulturen die anfängliche Portion von 2 mM NO3- verbraucht, wurden sie mit Portionen von 2 mM NO3- gefüttert. Die Anreicherungsstufen sind in Tab. 16 aufgeführt. Wachstumskurven wurden, aufgrund der fehlenden Zunahme der Optischen Dichte, anhand des NO3-- Verbrauches erstellt. Von Kulturen, die nach der 3. Anreicherungsstufe als vielversprechend eingestuft wurden, wurden im Weiteren Reinkulturen isoliert (Kap. III, 4.3). Tabelle 15: Proben aus den Werken Burghausen1 und Nünchritz2 der Firma Wacker Chemie AG Probe Ausgangsmaterial Mikroorganismen vorhanden P-1 Abwasser, kalt + P-2 Auffangwanne, kalt - P-3 Auffangwanne, 30°C ? P-4 Tanktasse + P-5 VIPO-Kolestor - P-6 AK-Öl-Kolestor - P-7 Abwasser - P-8 Mix - P-9 Waschwasser - P-10 Ablagerungen - P-11 Schmutzreste aus Phenylsilikonen - P-12 Wäscher, aufschwemmende Kieselsäure - P-13 Gullyabdichtung bei Wäscher, trocken - 2004, Burghausen P-14 aufschwimmende Kieselsäure + 2001, Burghausen P-C Klärschlammprobe + P-NA Wasser aus Kläranlage + 2004, Nünchritz P-NB Wasser aus Kläranlage + 1 In Burghausen werden Reinstsiliciumwafer, Silane und Silicone, Bindemittel und polymere Additive, Lösungen für die Feinchemie und Biotechnologie sowie polykristallines Silicium produziert (http://www.wacker.com). 2 In Nünchritz werden Silane, Silicone und pyrogene Kieselsäure produziert (http://www.wacker.com). Material und Methoden 22 Tabelle 16: Anreicherungsstufen Inokulum Zeit (d) seit Beginn der 1. Anreicherung 1. Anreicherung Proben P-1, P-4, P-7, P-14, P-C, P- NA, P-NB (Tab. 15) 0 2. Anreicherung entsprechende Kultur der 1. Anreicherung 46 3. Anreicherung entsprechende Kultur der 2. Anreicherung 108 4.3 Isolierung von Reinkulturen Zur Isolierung von Reinkulturen wurde eine serielle, dezimale Verdünnungsreihe (10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 und 10-7) in Grundmedium II (Tab. 11- 15) mit Trimethylsilanol (Endkonzentration 1 mM) als Substrat angesetzt. Als Inokulum diente die 3. Anreicherungsstufe der Probe P-C (vgl. Kap. III, 3.2). Um Aussagen über die Keimdichte (wahrscheinlichste Keimzahl) der Ausgangsprobe zu erhalten, wurde aus den Grenzverdünnungen die wahrscheinlichste Keimzahl (most probable number, MPN) ermittelt. Besonders wichtig ist, dass die Verdünnungsstufen so hoch gewählt wurden, dass ab einer Verdünnung (Grenzverdünnung) kein Wachstum mehr statt finden konnte. Um die statistische Genauigkeit für die Verteilung der Bakterien pro Röhrchen zu erhöhen, wurden pro Verdünnungsstufe jeweils mindestens 5 Röhrchen parallel angesetzt. Nach der Inkubation wurde die Stichprobenzahl (significant number) bestimmt, also die Zahl derjenigen Hungate-Röhrchen, in denen Wachstum festgestellt werden konnte. Anhand von Auswertetabellen, die von McCrady (1915) entwickelt wurden und z.B. in Oberzill (1967) zu finden sind, wurde die wahrscheinlichste Keimzahl für eine bestimmte Verdünnungsstufe (in Abhängigkeit von der verwendeten Tab.) bestimmt. Wird die wahrscheinlichste Keimzahl durch die zugehörige Verdünnungsstufe geteilt, so ergibt sich die wahrscheinlichste Keimzahl der Ausgangsprobe. Material und Methoden 23 4.4 Anzucht mit 14C-markiertem DMSD als Substrat 4.4.1 Anaerobe Anzucht von Paracoccus sp. IO-1 und Ochrobactrum sp. Si-1 mit 14C-DMSD als Substrat Kulturen von Paracoccus sp. IO-1 und Ochrobactrum sp. Si-1 wurden anaerob in Hungate-Röhrchen mit 14C-markiertem DMSD als Substrat in Grundmedium I (Tab. 2-10) angezogen. Folgende Mediumzusammensetzung wurde verwendet: Dem Grundmedium I (Tab. 2-10) wurde NaHCO3 als mögliche CO2-Quelle zugegeben. 14C-DMSD (3,7 MBq x mmol-1) wurde von der Firma Wacker Chemie AG (München) als 10 mM-Stammlösung zur Verfügung gestellt. Die Kulturen wurden mit 1 % einer auf nicht markiertem DMSD angezogenen Kultur angeimpft. Tabelle 17: Mediumzusammensetzung für die anaerobe Anzucht mit 14C-DMSD als Substrat zugegebene Menge Endkonzentration im Medium Grundmedium I (Tab. 2) 1 l NaHCO3 (Tab. 12) 40 ml/l 40 mM CaCl2-Lösung (Tab. 3) 1 ml/l 0,2 mM MgSO4-Lösung (Tab. 4) 1 ml/l 1,6 mM Selenit-Wolframat-Lösung (Tab. 7) 1 ml/l 1fach Vitaminlösung VL7 (Tab. 5) 1ml/l 1fach Spurenelementlösung SL10 (Tab. 6) 1ml/l 1fach Na-Acetat (Tab. 9) 2 ml/l 200 µM NaNO3-Lösung (Tab. 8) 2 ml/l 2 mM 14C-DMSD (vgl. Kap. III, 1.3) 100 ml/l 1 mM Zu Beginn der Anzucht erhielten die Kulturen 2 mM Nitrat und zusätzlich 200 µM Acetat, um die Stoffwechselaktivität zu steigern. Die Inkubation erfolgte 6 Monate bei Raumtemperatur auf einer Wippe im Isotopenlabor in Freiburg. Aufgrund des sehr langsamen Wachstums der Kulturen und der fehlenden Zunahme der Optischen Dichte (OD) wurde das Wachstum anhand des Nitratverbrauches verfolgt. Sobald die Kulturen die vorgelegte Portion von 2 mM NO3- verbraucht hatten, wurden sie mit 2 mM NO3- und 200 µM Acetat gefüttert. Material und Methoden 24 4.4.2 Aerobe Anzucht von Arthrobacter sp. ATCC 700240 50 ml-Kulturen von Arthrobacter sp. wurden aerob in verschlossenen 500 ml- Flaschen angezogen, um das Entweichen von 14C-CO2 zu verhindern. Die Kulturen wurden in LB-Medium (Tab. 14) und in Medium für Arthrobacter (Tab. 18 und 19) angezogen. Die Kulturen wurden mit 0,2 % (v/v) einer auf LB- Medium (Tab. 14) angezogenen Kultur angeimpft. Tabelle 18: Medium für die Anzucht von Arthrobacter sp. ATCC 700240 (Sabourin et al. 1996) Zugegebene Menge Endkonzentration im Medium K2HPO4 5,65 g/l 32 mM NaH2PO4 2,7 g/l 17 mM NH4Cl 0,5 g/l 9,3 mM MgSO4 x 7 H2O 0,2 g/l 0,8 mM CaCl2 x 2 H2O 0,011 g/l 0,07 mM Hefeextrakt 0,05 g/l Tabelle 19: Supplemente für das Medium die Anzucht von Arthrobacter sp. ATCC 700240 Zugegebene Menge Endkonzentration im Medium Spurenelementelösung SL10 (Tab. 6) 1 ml/l 1-fach 14C-DMSD (vgl. Kap. III, 1.3) 100 ml/l 1 mM 4.4.3. Probenentnahme von Kulturen, die mit 14C-DMSD als Substrat angezogen wurden Von Beginn der Anzucht an wurden Proben der Kulturen von Paracoccus sp. IO-1, Ochrobactrum sp. Si-1 und Arthrobacter sp. ATCC 700240 zum Nachweis von 14C- CO2 entnommen und mit Bariumchlorid gefällt (Kap. III, 7.2). Ab Tag 96 wurden zusätzlich Proben zum Nachweis der Konzentration an 14C-DMSD für die HPLC- Analyse entnommen (Kap. III, 7.1). 4.5 Anzucht von Paracoccus sp. IO-1, Ochrobactrum sp. Si-1 und Arthrobacter sp. ATCCC 700240 mit nicht markiertem DMSD Die anaerobe Anzucht von Paracoccus sp. IO-1 und Ochrobactrum Si-1 sowie die aerobe Anzucht von Arthrobacter sp. ATCC 700240 erfolgte analog der Anzucht der Kulturen mit 14C-DMSD (Tab. 17). Anstelle des 14C-DMSD wurde nicht Material und Methoden 25 markiertes DMSD als Substrat verwendet. Das nicht markierte DMSD wurde freundlicherweise von der Firma Wacker Chemie AG (München) zur Verfügung gestellt (Kap. III, 3.1.5). Während des Wachstums wurden Proben zum Nachweis der Konzentration an DMSD für die HPLC- (Kap. III, 7.1) und NMR-Analyse (Kap. III, 7.4) entnommen. 4.6 Anzuchten im 5 l Fermenter Anzuchten im 5 l-Fermenter (BIOSTAT B, Fa. B. Braun Biotech International, jetzt Fa. Sartorius BBI Systems, Melsungen) wurden anaerob mit komplettiertem Grundmedium I (Tab. 2-10) nach Anleitung des Herstellers betrieben. Hierzu wurde das Grundmedium I (Tab. 2) im Fermenter für 60 min bei 120 °C und 1 bar autoklaviert und nach dem Abkühlen mit den entsprechenden Substanzen (Tab. 3-10) komplettiert. Als mögliche CO2-Quelle wurde noch 40 mM NaHCO3 zugegeben. Während des Wachstums wurden die Parameter pH-Wert, pO2 (Sauerstoffpartialdruck), Temperatur und Rührgeschwindigkeit verfolgt. Fermenter mit Isobutyrat als Substrat: Die Anfangskonzentration an Isobutyrat betrug 10 mM und die von NO3- 30 mM. Bei hohen Konzentrationen von Isobutyrat (über 50 mM) wird das Wachstum von Paracoccus sp. IO-1 gehemmt. Um einen möglichst hohen Ertrag während der Anzucht im Fermenter zu erhalten, wurde die Kultur während des Wachstums mit einem Gemisch aus Isobutyrat und NO3- im Verhältnis 1:3 gefüttert. Das Wachstum wurde anhand der Optischen Dichte verfolgt. Die optimale Fütterungsrate wurde wie folgt berechnet: Nitratreduzierer assimilieren ein Drittel des Kohlenstoffes zu Biomasse, wodurch sich ein Ertragskoeffizient (Tab. 20) von Y= 0,33 ergibt. Anhand des molaren Ertragskoeffizienten Ym (Tab. 20) läßt sich berechnen, wieviel Trockengewicht pro mol Isobutyrat zu erwarten ist. Wird Ym in die Gleichung für den metabolischen Quotienten (Tab. 20) eingesetzt, läßt sich berechnen, wie die maximale Fütterungsrate der Kultur zu dem aktuellen Zeitpunkt ist. Zusätzlich wurde auch Material und Methoden 26 noch eine 2 M HCl-Lösung an den Fermenter gehängt, damit mit fortschreitendem Wachstum einer Alkalisierung entgegengewirkt werde konnte. Die Verdopplungszeit von Paracoccus sp. IO-1 mit Isobutyrat als Substrat ist 3 h (Kap. IV, 4.2). Tabelle 20: Parameter zur Berechnung der maximalen Fütterungsrate Formel Beschreibung Ertragskoeffizient Y= X/ S Ertrag pro g verbrauchten Substrates molarer Ertragskoeffizienten Ym= X/[S] Ertrag pro mol verbrauchten Substrates Ym= 150 g (Feuchtgewicht)/mol Isobutyrat metabolischer Quotient Q= µ /Y [min/µmol g] Maß für die aktuelle Substratverbrauchsrate in einer wachsenden Kultur exponentielle Wachstumsrate µ =lgxt-lgx0 lge (t-t0) Verdopplungszeit ln2/µ Tabelle 20a: Beispielrechnung zur Bestimmung der maximalen Fütterungsrate während des Wachstums von Paracoccus sp. IO-1 mit Isobutyrat als Substrat. µµµµ, Q: s. Tab. 20. Ausgewählt wurde der Zeitpunkt t= 22,5 h (Phase I, exponentielle Phase; Kap. IV, 4.2). Gefüttert wurde mit 80 % der maximalen Fütterungsrate. Zeit [h] 22,5 OD ~ 1 µ [h-1] 0,239 Q Es gilt: OD 1, 5 l Fermenter: 5 g Feuchtmasse werden gebildet 0,239 150 g/mol x 60 min = 26,6 µmol/g x min Q= 132 µmol/min 80% der maximalen Fütterungsrate 105 µmol/min Isobutyrat-Stammlösung von 526 mM (Fütterungsrate 105 µmol/min) Pumprate von 0,2 ml/min Die Fütterungsrate wurde im weiteren Verlauf des Wachstums alle 3 h neu berechnet und eventuell die Pumprate erhöht oder konstant gehalten (über Nacht) Fermenter mit D5 als Substrat: D5 wurde in einer Endkonzentration von 1 % als Substrat für Paraoccus sp. IO-1 im 5 l-Fermenter (Kap. III, 4.6) eingesetzt. Die Anfangskonzentration an NO3- betrug 2 mM. Wurde die Portion des vorgelegten Material und Methoden 27 Nitrats verbraucht, wurde mit 2 mM NO3- nachgefüttert. Zusätzlich wurden die Fermenter mit 200 µM Na-Acetat-Portionen und insgesamt mit 600 µM – 5,2 mM Na-Acetat gefüttert. Nach 70 - 100 Tagen Wachstum wurden die Fermenter geerntet. Während des Wachstums wurden Proben entnommen und eine 16 S rDNA-Sequenzierung (Kap. III, 8.4.1) durchgeführt. Weiterhin wurde von den auf D5 wachsenden Bakterien transmissions- und rasterelektronenmikroskopische (Kap. III, 4.7.2) Aufnahmen gemacht. Mit den geernteten Zellen der Fermenter wurde das Proteinmuster der auf D5 gewachsenen Bakterien anhand von 1-D- und 2-D-Gelelektrophorese (Kap. III, 6.3.1 und 6.3.2) untersucht und induzierte Proteine mittels MALDI-TOF-MS (Kap. III, 6.5) analysiert. 4.7 Morphologische Charakterisierung 4.7.1 Lichtmikroskopie Zur Reinheitskontrolle und zur Kontrolle des Wachstums der Bakterien wurde ein Axiolab-Mikroskop mit Phasenkontrast der Firma Carl Zeiss (Jena) verwendet. 4.7.2 Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden an einem Transmissions- Elektronenmikroskop (EM 109 R) der Firma Carl Zeiss durchgeführt. Die Fotos wurden bei 4000-85000facher Vergrößerung mit einer TFP Kamera (7mm-Film) aufgenommen. Die Negative wurden eingescannt und digital weiterverarbeitet. Um die Form der Bakterien sowie eventuelle phänotypische Unterschiede von auf verschiedenen Substraten gezogen Bakterien darzustellen, wurden jeweils ca. 200 µl einer Bakterienkultur auf einen Parafilmstreifen gegeben. Ein mit Kohlenstoff beschichtetes Gitter (300 Maschen/Zoll) wurde für eine Minute in diesem Bakterientropfen inkubiert und die Flüssigkeit anschließend mit einem Filter abgezogen. Das Gitter wurde dann für 30 sec in Uranyl-Acetat (2 %, pH 6,0) überführt und nach Abziehen der Flüssigkeit kurz mit Aqua bidest. abgespült. Material und Methoden 28 Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. G. Wanner, Department Biologie I, LMU München, aufgenommen. 4.8 Physiologische Charakterisierung 4.8.1 Substratspektrum Die anaeroben Substratspektren der verschiedenen Stämme wurden in Hungate- Röhrchen in je 10 ml Grundmedium I (Tab. 2-10) untersucht. Das Medium enthielt Nitrat als Elektronenakzeptor in einer Anfangskonzentration von 2 mM und wurde mit folgenden Substraten aus anaeroben, sterilen Stammlösungen supplementiert: Tabelle 21: verwendete Substrate Substrate Endkonzentration im Medium Silikonöl M50 1 % (v/v) * Decamethylcyclopentasiloxan (D5) 1 % (v/v) * Octamethylcyclopentasiloxan (D4) 1 % (v/v) Dimethylsilandiol (DMSD) 1 mM tert-Butanol 0,1 % (v/v) DMSO 0,1 % (v/v) Methanol 1 mM Isooktan* 1 % (v/v) Isobutyrat 5 mM Acetat 5 mM *: Die Substrate bildeten mit dem Medium ein Zwei-Phasen-System Die Medien wurden mit 1 % (v/v) Bakterienvorkultur beimpft und bei 30 °C inkubiert. Das Bakterienwachstum wurde über mehrere Tage bis Monate anhand der OD, des Nitratverbrauches, der Nitritbildung und durch mikroskopische Kontrolle verfolgt. 4.8.2 Abbaufähigkeiten und Eigenschaften Um die Verwertung verschiedener Substanzen (Tab. 22) und weitere Eigenschaften (Tab. 23) der Stämme Paracoccus sp. IO-1, Paracoccus denitrificans PD1222 und Ochrobactrum sp. Si-1 zu untersuchen, wurden spezielle Medien nach dem Script „Grundpraktikum Mikrobiologie“ angesetzt (Pfeifer et al. 2006). Material und Methoden 29 Tabelle 22: Medien für den Versuch zur Verwertung verschiedener Substanzen Verwertung von nach Pfeifer et al. 2006 Citrat Citrat-Agar; s. S: 11 Eigelb-Proteinen (Vorhandensein von Proteinasen) Eigelb-Tellurit-Lithium-Agar; s. S. 11 Lecithin (Vorhandensein von einer Lecithinase) Eigelb-Tellurit-Lithium-Agar; s. S. 11 Stärke Stärke-Agar; s. S. 14 Harnstoff (Urease-Aktivität) Harnstoff-Pepton-Agar; s. S. 11 Tryptophan (Indol-Bildung) Nachweis von Indol; s. S. 18 Tabelle 23: Tests für den Versuch zur Charakterisierung weiterer Eigenschaften Eigenschaften nach Pfeifer et al. 2006 Denitrifikation Nitratmedium; s. S. 12 Ammonifikation Neßlers-Reagenz; s. S. 18 Oxidation/Fermentation (Gasproduktion und aerobes/anaerobes Wachstum) OF-Testmedium; s. S. 13 4.9 Wirkung verschiedener Substanzen auf das Wachstum 4.9.1 Minimale Hemmkonzentration (MHK) verschiedener Substanzen Die MHK ist die Konzentration, die ausreicht, um das Bakterien-Wachstum zu hemmen. Der Versuch wurde im 10 ml-Maßstab in Hungate-Röhrchen unter anaeroben Bedingungen in Grundmedium I (Tab. 2-10) mit 10 mM Acetetat durchgeführt. Als zu testende Substanzen wurden DMSD, Trimethylsilanol, tert- Butanol und Methanol in den Konzentrationen 0 mM; 0,156 mM; 0,3125 mM; 0,625 mM; 1,25 mM; 2,5mM; 5 mM und 10 mM eingesetzt. 4.9.2 Toxizität verschiedener Substanzen Mit diesem Versuch wurde die bakterizide Wirkung von DMSD und Trimethylsilanol bestimmt. Die Silanole wurden in Konzentrationen von 0 mM, 1mM, 10 mM, 100 mM und 200 mM eingesetzt. Von anaerob wachsenden Kulturen mit Isobuttersäure als Substrat wurde in der exponentiellen Phase eine Bakteriensuspension hergestellt. Hierfür wurden 10 ml der Kultur 10 min bei 5000 rpm zentrifugiert, anschließend wurde das Pellet mit sterilem und komplettiertem Grundmedium I (Tab. 2-10) ohne Substrat gewaschen. Das Pellet wurde dann in 1 ml sterilem und komplettiertem Grundmedium I resuspendiert. Ein typischer Ansatz zur Überprüfung der Toxizität von DMSD und Material und Methoden 30 Trimethylsilanol ist in Tab. 24 dargestellt. Die Inkubation der Ansätze erfolgte in sterilen Petrischalen für 1 h bei 28 °C auf einer Wippe. Danach wurde eine Verdünnungsreihe mit Verdünnungsstufen von 10-1 bis 10-7 angesetzt und jeweils 100 µl auf eine LB-Platte ausgestrichen. Nach Inkubation von 48 h wurden die Kolonien auf den Platten ausgezählt und die Toxizität von DMSD und Trimethylsilanol bestimmt. Tabelle 24: Ansatz zur Überprüfung der Toxizität von DMSD und Trimetylsilanol Zusammensetzung Grundmedium I, komplettiert (Tab. 2-10) 10 ml Silanol 0 mM; 1mM; 10 mM;100 mM; 200 mM Bakteriensuspension 1 ml 4.10 Messung des Bakterienwachstums 4.10.1 Photometrische Kontrolle des Bakterien-Wachstums Das Wachstum der Bakterienkulturen wurde in der Regel photometrisch verfolgt. Die Optische Dichte (OD) der Zellkulturen wurde bei einer Wellenlänge von 578 nm in 1-cm-Plastikküvetten gemessen. Als Leerwert wurde das frisch komplettierte und beimpfte Medium der entsprechenden Kulturen verwendet. Besonders bei langsam wachsenden Kulturen und bei Kulturen, die auf wasserunlöslichen Substraten gewachsen sind und bei denen das Wachstum daher nicht anhand der OD beobachtet werden konnte, wurde das Wachstum anhand des Nitratverbrauches protokolliert. 4.10.2 Nachweis von Nitrat und Nitrit Die fortschreitende Denitrifikation des vorgelegten Nitrats während des Wachstums der Bakterienkulturen wurde qualitativ mit NO3-/NO2--Stäbchen (Quantofix®, Fa. Macherey-Nagel, Düren) überprüft. Der Nitratnachweis wird durch Nitrit im Testansatz gestört. Deshalb wurden 2 % (v/v) einer 10%igen Amidoschwefelsäure zum Testansatz gegeben, um das Nitrit zu binden. Material und Methoden 31 5 Isolierung von 14C-DMSD abbauenden Mikroorganismen unter verschiedenen Bedingungen Mit dem 14C-DMSD stand eine weitere Möglichkeit zur Verfügung, direkt nach Silanol-abbauenden Mikroorganismen zu suchen und gleichzeitig die Produkte wie 14C-CO2 zu messen. Als Ausgangsmaterial wurde eine Probe (Tab 33) aus einem Klärbecken der Silikonöl produzierenden Firma Wacker Chemie AG in Nünchritz entnommen. Als weiteres Inokulum wurde ein Mix (Tab. 33) aus verschiedenen Klärbecken verwendet. Die Anreicherungskulturen erhielten jeweils 1 mM 14C-DMSD und wurden unter verschiedenen Bedingungen angezogen. Dieses umfangreiche Screening umfasste die Anreicherung unter denitrifizierenden (Kap. III, 5.1.1), sulfatreduzierenden (Kap. III, 5.1.2) methanogenen (Kap. III; 5.1.3) und aeroben (Kap. III, 5.1.4) Bedingungen. Zusätzlich wurden Substratanaloga (DMSO, 1 mM) und Substanzen (Aceton/2- Propanol (1mM) und Hefeextrakt (0,045 %)), von denen die Förderung des DMSD-Abbaus in Form einer cometabolischen Wirkung bekannt ist, hinzu gegeben. Auch wurden entsprechende Kontrollen (Tab. 36) mit sterilem Inokulum angesetzt. Die Anreicherungen wurden für 68 Tage bei 30 °C inkubiert. Zu Beginn des Versuches und nach 68 Tagen wurde von jedem Ansatz eine Probe entnommen und eine Bariumchlorid-Fällung (Kap. III, 8.2) zur Bestimmung des 14C-CO2-Gehaltes durchgeführt. 5.1 Herstellung der Medien 5.1.1 Medium für die Anreicherung von denitrifizierende Mikroorganismen Die Medien (Tab. 25) und Lösungen (Tab. 2-10) wurden wie unter Kap. 3.1 beschrieben hergestellt und in mit N2 begaste Hungate-Röhrchen gefüllt. Material und Methoden 32 Tabelle 25: Zusammensetzung des Mediums für die anaerobe Anreicherung von Mikroorganismen mit 14C-DMSD als Substrat unter denitrifizierenden Bedingungen zugegebene Menge Endkonzentration im Medium Grundmedium I (Tab. 2) 1 l NaHCO3 (Tab. 12) 40 ml/l 40 mM CaCl2-Lösung (Tab. 3) 1 ml/l 0,2 mM MgSO4-Lösung (Tab. 4) 1 ml/l 1,6 mM Selenit-Wolframat-Lösung (Tab. 7) 1 ml/l 1fach Vitaminlösung VL7 (Tab. 5) 1ml/l 1fach Spurenelementlösung SL10 (Tab. 6) 1ml/l 1fach NaNO3-Lösung (Tab. 8) 10 ml/l 10 mM 14C-DMSD (vgl. Kap. III, 1.3) 100 ml/l 1 mM 5.1.2 Medium für die Anreicherung von sulfatreduzierenden Mikroorganismen Das Grundmedium für sulfatreduzierende Mikroorganismen wurde wie in Tab. 26 beschrieben angesetzt, mit den in Tab. 27-29 angegebenen Substanzen nach dem Autoklavieren komplettiert und in mit N2 begaste Hungate-Röhrchen gefüllt. Tabelle 26: Zusammensetzung des Mediums für die anaerobe Anreicherung von Mikroorganismen mit 14C-DMSD als Substrat unter sulfatreduzierenden Bedingungen zugegebene Menge Endkonzentration im Medium Grundmedium für Sulfatreduzierer (Tab. 27) 1 l NaHCO3 (Tab. 12) 50 ml/l 50 mM Selenit-Lösung für Sulfatreduzierer 1 ml/l 1fach Vitaminlösung VL7 (Tab. 5) 1ml/l 1fach Sulfid-Lösung (Tab. 29) 32 ml/l 4 mM 14C-DMSD (vgl. Kap. III; 1.3) 100 ml/l 2 mM Material und Methoden 33 Tabelle 27: Grundmedium für Sulfatreduzierer Zusammensetzung Einwaage Na2SO4 3 g/l KH2PO4 1 g/l NH4Cl 0,3 g/l NaCl 7 g/l MgCl2 x 6 H2O 1,2 g/l Tabelle 28: Zusammensetzung der Selenit-Lösung für Sulfatreduzierer (1000fach) Zusammensetzung Einwaage NaOH 1,2 g/l Na2SeO3 7,5 mg/l Tabelle 29: Zusammensetzung der Sulfid-Lösung (62,5 mM) Zusammensetzung Einwaage Na2S x 9 H2O 380,6 g/l 5.1.3 Medium für die Anreicherung von Methanogenen Die Medien und Lösungen wurden für 30 min mit Stickstoff und anschließend für 1 min mit CO2 begast. Nach Ablauf dieser Zeit wurde 10 mM NaHCO3 (Tab. 12) hinzugefügt. Es wurde mit 6 N NaOH ein pH-Wert von 6,9 eingestellt und die Lösungen wurden autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wies das Medium eine rosa Farbe auf. Das Medium wurde mit denen in Tab. 30 angegebenen Komponenten komplettiert und auf mit N2 und CO2 begaste Hungate-Röhrchen verteilt. Material und Methoden 34 Tabelle 30: Zusammensetzung des Mediums für die Anreicherung von Methanogenen (pH 6,9) Tabelle 31: Grundmedium für Methanogene (pH 6,9) Zusammensetzung Einwaage K2HPO4 0,384 g/l KH2PO4 0,227 g/l NH4Cl 0,5 g/l MgSO4 x 7 H2O 0,5 g/l FeSO4 x 7 H2O 0,002 g/l CaCl x 2 H2O 0,125 g/l NaCl 2,25 g/l Hefeextrakt 2 g/l Casiton 2 g/l Resazurin 0,001 g/l Tabelle 32: Zusammensetzung Cystein-HCl-Lösung (85,5 mM) Zusammensetzung Einwaage Cystein-HCl 134,7 g/l 5.1.4 Medium für die Anreicherung aerober Mikroorganismen Das Medium für die Anreicherung aerober Mikroorganismen wurde wie folgt angesetzt. Grundmedium I wurde autoklaviert und anschließend mit den in Tab. 33 angegebenen Substanzen komplettiert. Das komplettierte Medium wurde dann in 500 ml Serumflaschen mit Naturkautschukstopfen gefüllt, die nicht anaerobisiert wurden und demnach aerob blieben. Zusammensetzung zugegebene Menge Endkonzentration im Medium Grundmedium für Methanogene 1 l Spurenelementelösung SL10 (Tab. 6) 1 ml /l 1fach Vitaminlösung (Tab. 5) 1 ml/l 1fach Cystein-HCl (Tab. 32) 24 ml 2 mM Na2S x 9 H2O (Tab. 29) 16 ml 1 mM Material und Methoden 35 Tabelle 33: Zusammensetzung des Mediums für aerobe Mikroorganismen zugegebene Menge Endkonzentration im Medium Grundmedium I (Tab. 2) 1 l NaHCO3 (Tab. 12) 40 ml/l 40 mM CaCl2-Lösung (Tab. 3) 1 ml/l 0,2 mM MgSO4-Lösung (Tab. 4) 1 ml/l 1,6 mM Selenit-Wolframat-Lösung (Tab. 7) 1 ml/l 1fach Vitaminlösung VL7 (Tab. 5) 1ml/l 1fach Spurenelementlösung SL10 (Tab. 6) 1ml/l 1fach 14C-DMSD (vgl. Kap. III, 1.3) 100 ml/l 1 mM Tabelle 34 : Ausgangsmaterial für Ansätze des Screening-Versuchs Zusammensetzung und Herkunft des Ausgangsmaterials Nünchritz Belebtschlamm vom 03.04.2007 Klärschlammmix Faulschlamm aus der Kläranlage Darmstadt vom April 2007, Belebtschlamm aus der Kläranlage Darmstadt vom April 2007, Probe C: Klärschlamm aus Burghausen aus dem Jahr 2001 und Belebtschlamm aus Nünchritz vom 03.04.2007 5.2 Kulturansätze des Screening-Versuches Die Kulturen wurden von 1-69 durchnummeriert und sind in Tab. 35-37 aufgeführt. Angegeben ist weiterhin die Herkunft des Inokulums (Tab. 34) und in welcher Verdünnung dieses eingesetzt wurde, sowie die Zugabe eines zur Steigerung der Stoffwechselaktivität hinzugefügten weiteren Substrates. Die verdünnten Ansätze wurden mit 9 ml des jeweiligen Mediums und mit 1 ml des entsprechenden Inokulums angeimpft, so dass sich eine Verdünnung des Inokulums von 1:10 ergab. Für die unverdünnten Ansätze wurden 5 ml Inokulum mit 14C-DMSD und dem entsprechendem Elektronenakzeptor komplettiert und in die entsprechenden Gefäße gefüllt. Material und Methoden 36 Tabelle 35: Anaerobe Kulturansätze des Screening-Versuches Kulturnr. Inokulum Kulturnr. Inokulum zusätzliche C-Quelle [Endkonzentration im Ansatz] Elektronenakzeptor: Nitrat (Endkonzentration im Ansatz 10 mM) 1 22 - 2 23 DMSO (1 mM) 3 24 Aceton/2-Propanol (1 mM) 4 Nünchritz, 1:10 25 Klärschlammmix, 1:10 Hefe (0,045 %) 5 Nünchritz, unverdünnt 26 Klärschlammix, unverdünnt - 6 27 DMSO (1 mM) 7 28 Aceton/2-Propanol (1 mM) Elektronenakzeptor: Sulfat (Endkonzentration im Ansatz 21 mM) 8 29 - 9 30 DMSO (1 mM) 10 31 Aceton/2-Propanol (1 mM) 11 Nünchritz, 1:10 32 Klärschlammmix, 1:10 Hefe (0,045 %) 12 33 - 13 34 DMSO (1 mM) 14 Nünchritz, unverdünnt 35 Klärschlammix, unverdünnt Aceton/2-Propanol (1 mM) methanogene Bedingungen 15 36 - 16 37 DMSO (1 mM) 17 38 Aceton/2-Propanol (1 mM) 18 Nünchritz, 1:10 39 Klärschlammmix, 1:10 Hefe (0,045 %) 19 40 - 20 41 DMSO (1 mM) 21 Nünchritz, unverdünnt 42 Klärschlammix, unverdünnt Aceton/2-Propanol (1 mM) Material und Methoden 37 Tabelle 36:Aerobe Kulturansätze des Screening-Versuches Kulturnr. Inokulum zusätzliche C-Quelle [Endkonzentration im Ansatz] Elektronenakzeptor: Sauerstoff 43 - 44 DMSO (1 mM) 45 Aceton/2-Propanol (1 mM) 46 Nünchritz, 1:10 Hefe (0,045 %) 47 - 48 DMSO (1 mM) 49 Aceton/2-Propanol (1 mM) 50 Nünchritz, unverdünnt Hefe (0,045 %) Elektronenakzeptor: Sauerstoff 51 - 52 DMSO (1 mM) 53 Aceton/2-Propanol (1 mM) 54 Klärschlammix, 1:10 Hefe (0,045 %) 55 - 56 DMSO (1 mM) 57 Aceton/2-Propanol (1 mM) 58 Klärschlammix, unverdünnt Hefe (0,045 %) Material und Methoden 38 Tabelle 37: Kontrollansätze des Screening-Versuches. Das jeweilige Inokulum wurde zuvor autoklaviert. Kulturnr. Inokulum zusätzliche C-Quelle [Endkonzentration im Ansatz] Elektronenakzeptor: Nitrat (Endkonzentration im Ansatz 10 mM) 59 - 60 DMSO (1 mM) 61 Aceton/2-Propanol (1 mM) 62 steriler Klärschlammmix, 1:10 Hefe (0,045 %) Methanogene Bedingungen 63 steriler Klärschlammmix, 1:10 - Elektronenakzeptor: Sulfat (Endkonzentration 21 mM) 64 steriler Klärschlammmix, 1:10 - Elektronenakzeptor: Nitrat (Endkonzentration im Ansatz 10 mM) 65 steriler Klärschlammmix, unverdünnt - Methanogene Bedingungen 66 steriler Klärschlammmix, unverdünnt - Elektronenakzeptor: Sulfat (Endkonzentration im Ansatz 21 mM) 67 steriler Klärschlammmix, unverdünnt - Elektronenakzeptor: Sauerstoff 68 steriler Klärschlammix, 1:10 - 69 steriler Klärschlammix, unverdünnt - 6 Herstellen von Zellextrakten und Stammkulturhaltung 6.1 Zellernte Zellernte von Kulturen auf wasserlöslichen Substraten: Die Zellen wurden je nach Substrat bei OD-Werten von ca. 0,1-8,0 geerntet. Die Kulturen wurden in 250-600 ml-Zentrifugenbecher umgefüllt und in der Kühlzentrifuge (Zentrifuge: RC5C und Rotor: GS3, Fa. Sorvall Instruments Du Pont, Bad Homburg) für 20 Material und Methoden 39 min bei +4 °C und 9000 rpm abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 1-5 ml Überstand aufgenommen und in einem Eppendorfgefäß bei 14000 rpm noch einmal für 10 min abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde dann bei -20 °C eingefroren. Zellernte von Kulturen auf wasserunlöslichen Siloxanen: Zellen von Paracoccus sp. Stamm IO-1, die auf dem Siloxan D5 gewachsen waren, konnten nicht nur durch Zentrifugation geerntet werden. Stattdessen wurde zunächst die wässrige Phase der Kulturen mittels eines Steigrohres größtenteils abgelassen, nachdem die Kulturen für 30 min mit dem Flaschenhals nach unten gelagert worden waren. Die verbliebene wässrige Phase und die organische Phase mit den Zellen wurden in einen Scheidetrichter gefüllt, in dem sich beide Phasen trennten. Nach 30 min wurde die wässrige Phase abgelassen, die organische Phase mit den anhaftenden Zellen wurde aufgefangen und 10 min bei 12000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation waren drei Phasen zu erkennen. Die organische Phase befand sich oben und die wässrige Phase unten, während die Zellen eine gelbliche Interphase an der Grenzschicht bildeten. Sowohl die organische als auch die wässrige Phase wurden nun vorsichtig abgezogen, die verbliebenen Zellen in ca. 5 ml wässriger Phase suspendiert und in Portionen von je 1,5 ml auf Eppendorfgefäße verteilt. Die Zellen wurden dann in der Eppendorfzentrifuge so lange bei 14000 rpm zentrifugiert, bis sich ein Niederschlag bildete. Der Überstand wurde vollständig abgezogen und das Pellet bei -20 °C gelagert. 6.2 Zellaufschluß Zellaufschluß mit Lysozym: Bei geringen Zellmengen wurden die Zellen durch Behandlung mit Lysozym aufgeschlossen. Hierfür wurden ca. 100 mg Zellen in Tris/HCl-Puffer (Tab. 38) resuspendiert und mit den in Tab. 38 aufgeführten Lösungen versetzt. Der Ansatz wurde dann für 30 min bei 37 °C auf einem Thermomixer 5436 (Fa. Eppendorf, Hamburg) und anschließend dreimal für 10 sec im Ultraschallbad inkubiert. Dann wurde der Ansatz für 10 min in einer Eppendorfzentrifuge bei 14000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde sofort weiter verwendet oder bei -20 °C aufbewahrt. Material und Methoden 40 Tabelle 38: Lösungen für den Zellaufschluß mit Lysozym Konzentration der Stammlösung Zusammensetzung eines Ansatzes Tris/HCl- Puffer 10 mM, pH 7,5 500 µl Lysozym 10 mg/ml 5 % (v/v) EDTA 0,25 M 4 % (v/v) DNAse 0,1 % (w/v) Zellaufschluss mit der French Press: Bei größeren Zellmengen wurden die Zellen mit einer French Press (Fa. American Instruments Company, Maryland, USA) aufgeschlossen. Die gefrorenen Zellen wurden in 2 Volumen 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) und 0,1 % (w/v) DNAse aufgenommen, bei +4 °C in eine vorgekühlte kleine French Press-Zelle eingefüllt, bei 110 MPa aufgeschlossen und anschließend bei 40000 rpm und 4 °C für 60 min zentrifugiert (Beckmann Ultrazentrifuge L-60, 70 Ti-Festwinkelrotor, München). Der Überstand wurde sofort weiter verwendet, bei -20 °C aufbewahrt oder mit 10 % Glycerin (v/v) versehen und bei -70 °C gelagert. 6.3 Stammkulturhaltung Von Flüssigkulturen in der exponentiellen Wachstumsphase wurden je 10 ml entnommen, in sterile Hungate-Röhrchen transferiert und 10 min bei +4 °C mit 6000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellmaterial in 10 ml steriles LB-Medium (Tab. 14) oder in Grundmedium I (Tab. 2-10) überführt, welches 5 % (v/v) DMSO enthielt. Diese Suspension wurde in Portionen von je ca. 2 ml in Cryoröhrchen (Fa. Nunc, Wiesbaden) bei -70 ° C gelagert. Alternativ wurden auf LB-Agarplatten gewachsene Bakterien mit 5 ml LB- Medium, das 5 % (v/v) DMSO enthielt, von der Platte abgeschwemmt und dann ebenfalls in Portionen von ca. 2 ml in Cryoröhrchen bei -70 °C gelagert. Material und Methoden 41 7 Biochemische Methode 7.1 Proteinbestimmung nach Bradford (1976) Die Bestimmung von Proteinkonzentrationen wurde nach der Methode von Bradford (1976) durchgeführt. Als Standard diente Albumin aus Rinderserum (BSA). 7.2 Fällungen 7.2.1 Ammoniumsulfat-Fällung Die potentielle Isobutyrat-CoA Ligase wurde mit einer gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung (pH 8, 0,1 mM EDTA) gefällt. Die gesättigte Ammoniumsulfat-Lösung wurde über einen Zeitraum von 30 min tropfenweise unter leichtem Rühren im Eisbad zur Proteinfraktion zugesetzt, bis eine Sättigung von 33 % erreicht war. Danach wurde 15 Minuten weitergerührt und das ausgefällte Protein anschließend für 15 min bei 10 000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde nach der 33 % Fällung weiterverwendet, wie oben beschrieben auf 60 % Sättigung eingestellt und abzentrifugiert. Das Pellet der 60 % Ammoniumsulfat-Fällung wurde in 10 mM TrisHCl (pH 8,0) aufgenommen und über Nacht in Puffer (10 mM TrisHCl, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 10 % Glycerin) dialysiert. 7.2.2 Trichloressigsäure-Fällung (TCA) Bei Proteinkonzentrationen von unter 1 µg/µl wurde vor dem Auftragen des Proteins auf ein 1-D-SDS-Polyacrylamidgel eine TCA-Fällung durchgeführt. Die entsprechende Proteinmenge (30 µg Protein) wurde in einem Eppendorfgefäß vorgelegt und 1/4 des Endvolumens an 24%iger TCA zugegeben. Der Ansatz wurde kurz gemischt und dann 30 min auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation des Ansatzes für 10 min bei 14000 rpm wurde der Niederschlag in 30 µl Probenpuffer (Tab. 41) resuspendiert. Material und Methoden 42 7.2.3 Trichloressigsäure (TCA)/Aceton-Fällung vor isoelektrischer Fokussierung Vor der isoelektrischen Fokussierung wurden die Proben unabhängig von der Proteinkonzentration unter reduzierenden Bedingungen mit einer 10 %igen TCA/Aceton-Lösung (Tab. 39) gefällt, um störende Bestandteile des Zellextraktes zu entfernen. Die entsprechende Proteinmenge (50-200 µg Protein plus 30 % der Endkonzentration, da dieses dem Verlust bei der Fällung entspricht) wurde in einem Eppendorfgefäß vorgelegt und 3 Volumen 10 %ige TCA/Aceton-Lösung (Tab. 39) zugegeben. Die Fällung erfolgte für 45 min bei -20 °C. Anschließend wurde der Ansatz für 10 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Centrifuge 5415R, Fa. Eppendorf, Hamburg). Das Pellet wurde in 3 Volumen einer Aceton-Lösung (Tab. 40) resuspendiert und erneut 10 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet bei 37 °C getrocknet und dann in 300 µl Rehydratisierungslösung (Tab. 46) resuspendiert. Ließ das Pellet sich nicht resuspendieren, wurde der Ansatz bei 37 °C erwärmt, bis sich das Pellet löste. Tabelle 39: 10 %ige TCA/Aceton-Lösung zugegebene Menge Endkonzentration TCA 1 g 10 % (w/v) DTE 31 mg 20 mM mit Aceton ad. 10 ml 90 % (v/v) Tabelle 40: Aceton-Lösung zugegebene Menge Endkonzentration DTE 31 mg 20 mM Aceton ad. 10 ml 100 % (v/v) 7.3 Elektrophoretische Methoden 7.3.1 Eindimensionale Polyacrylamid (1-D)-Gelelektrophorese Für die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (nach Laemmli 1970) wurden standardmäßig 12,5%ige Trenngele und 4%ige Sammelgele verwendet. Dabei wurden die Proteine im Sammelgel (pH 6,8) fokussiert und im Trenngel (pH 8,8) nach ihrer apparenten Molekularmasse aufgetrennt. Die Gele wurden entweder mit Coomassie-Blue R 250 (Zehr et al. 1989, modifiziert, Kap. Material und Methoden 43 III, 5.3.3) oder mit Silbernitrat (Heukeshoven und Dernick 1988) Kap. III, 6.3.3) gefärbt. Probenvorbereitung Die Proteinproben (ca. 20-25 µg) wurden mit 1 Volumen Probenpuffer (Tab.41) versetzt und 5 min bei 95 °C erhitzt. Proben mit geringen Proteinkonzentrationen wurden vor dem Auftragen auf ein 1-D-Gel mit Trichloressigsäure (Kap. III, 6.2.3) gefällt. Tabelle 41: Zusammensetzung des Probenpuffers Tris/HCl (pH 6,8) Glycerin SDS β-Mercaptoethanol Bromphenolblau-Lösung 50 mM 10 % (w/v) 2 % (w/v) 5 % (v/v) 0,025 % (w/v) Ein Molekularmassenmarker (20 µl) aus Standardproteinen (Tab. 42) wurde zusätzlich aufgetragen, um die Größe der aufgetrennten Proteine abschätzen zu können. Tabelle 42: Zusammensetzung des Molekularmassenmarkers Größe Phosphorylase b 97 kDa Rinderserumalbumin 67 kDa Ovalbumin 45 kDa Lactat-Dehydrogenase 34 kDa Carboanhydrase 29 kDa Lysozym 14 kDa Jeweils 100 µg/ml wurden in Probenpuffer (Tab. 41) gelöst, so dass jede Bande 2 µg Protein enthielt, und wie die Proteinproben behandelt. Gelzusammensetzung: Trenn- und Sammelgele (Tab. 43 und 44) setzten sich wie folgt zusammen: Material und Methoden 44 Tabelle 43: Zusammensetzung des Trenngels (12,5 %) Tabelle 44: Zusammensetzung des Sammelgels (4 %) Gelherstellung: Die Gele wurden nach Vorschrift im Gießtand der Mini- PROTEAN 3 Cell (Fa. Bio-Rad, München) hergestellt. In die Gießkammer wurde zunächst bis zu etwa Dreiviertel der Kammerhöhe das Trenngel (12,5 %) gegossen und die Oberfläche bis zur vollständigen Polymerisation mit Wasser überschichtet. Anschließend wurde das Wasser entfernt, das Sammelgel in die Kammer eingefüllt und der Taschenformer eingesetzt. Nach abgeschlossener Polymerisation wurde das Gel nach Anleitung der Mini-PROTEAN 3 Cell in die Elektrophoresekammer eingesetzt und die Kammer mit Laufpuffer (Tab. 45) gefüllt. Das maximale Auftragsvolumen betrug 30 µl pro Tasche. Laufbedingungen: Die Elektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur in Laufpuffer (Tab. 45). Zunächst wurde eine Spannung von 90 V angelegt, beim Einwandern der Lauffront in das Trenngel wurde die Spannung auf 140 V erhöht. Die Elektrophorese wurde gestoppt, sobald die Lauffront das Gelende erreicht hatte. Polyacrylamid/Bisacrylamid (30 %ig/0,8 %ig) 12,5 % Tris/HCl (2 M, pH 8,8) 450 mM SDS 0,1 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat 0,05 % (w/v) TEMED 0,001 % (v/v) Polyacrylamid/Bisacrylamid (30%ig/0,8%ig) 4 % Tris/HCl (2 M, pH 6,8) 125 mM SDS 0,1 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat 0,05 % (w/v) TEMED 0,001 % (v/v) Material und Methoden 45 Tabelle 45: Zusammensetzung des Laufpuffers Tris 3 g/l Glycin 14,4 g/l SDS 1 g/l 7.3.2 Zweidimensionale Polyacrylamid (2-D)-Gelelektrophorese Bei der 2-D-Gelelektrophorese werden Proteine nach zwei unabhängigen Kriterien aufgetrennt, nämlich dem isoelektrischen Punkt (1. Dimension) und der Molekularmasse (2. Dimension). Dabei können bis zu 2000 Proteine in einem Gel (Gorg et al. 2004) getrennt und Proteine von Kulturen verglichen werden, die auf verschiedenen Substraten gewachsen sind. Vorbereiten der Proben für die isoelektrische Fokussierung (IEF, 1. Dimension): Für die IEF wurden Proteinmengen zwischen 50 und 200 µg aufgetragen. Die Proben wurden vor der isoelektrischen Fokussierung immer mit Trichloressigsäure/Aceton gefällt (Kap. III, 6.2.3) und in Rehydratisierungslösung (Tab. 46) resuspendiert. Rehydratisierung und isoelektrische Fokussierung: Die Rehydratisierung der IEF-Streifen (Immobiline DryStrip, 18 cm, pH 3-10 oder 4-7; Fa. Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg) wurde für 12 h (Tab. 47) direkt in den „Probe-Schiffchen“ durchgeführt, die auch für die isoelektrische Fokussierung verwendet wurden. Die vorbereitete Probe (300 µl, Kap. III, 6.2.3) wurde in die „Probe-Schiffchen“ pipettiert. Die IEF-Streifen wurden dann mit der Gelseite nach unten in das Schiffchen geschoben. Dabei wurde darauf geachtet, dass das Gel an jedem Ende Kontakt zu den Elektroden hatte und sich unter dem IEF- Streifen keine Luftblasen befanden. Um die Verdunstung zu verringern, wurde der IEF-Streifen mit ca. 600 µl Paraffinöl überschichtet. Anschließend wurde der Deckel des Schiffchens aufgelegt. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte im Ettan IPGphor II der Firma Amersham Bioscience (Freiburg). Die Rehydratisierung und Fokussierung Material und Methoden 46 erfolgten nach dem in Tab. 47 angegebenen Programm. Die IEF-Streifen wurden nach der IEF entweder bei -20 °C gelagert oder gleich weiterverarbeitet (s.u.). Vorbehandlung der IEF-Streifen für die 2. Dimension: Die Gelstreifen wurden für 15 min in 10 ml Äquilibrierungspuffer (ÄP, Tab. 48) mit zugesetztem DTE (100 mg/10 ml ÄP) und anschließend für weitere 15 min in ÄP mit zugesetztem Iodoacetamid (480 mg/10 ml ÄP) äquilibriert. 2. Dimension (SDS-PAGE): Für die 2. Dimension wurde die ProteanII xi Cell der Firma Bio-Rad (München) nach Anleitung verwendet. Die Gelstreifen wurden in die vorgesehene Tasche eines 12,5%igen SDS-Poylacrylamidgeles (Tab. 43) eingeführt und mit 0,5%iger Agarose überschichtet. Vom Molekularmassenstandard (Tab. 42) wurden 10 µl auf ein Stück Whatman-Papier getropft und in die Marker-Tasche gesetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 300 V und wurde während des Laufes mit einer Wasserkühlung (K15 Thermo Elektron Corporation, Fa. Haake) auf 10 °C gekühlt. Die Elektrophorese wurde gestoppt, nachdem die Lauffront 20 min aus dem Gel ausgetreten war. Anschließend wurden die Gele mit Coomassie Brilliantblau oder Silbernitrat gefärbt (Kap. III, 6.3.3). Tabelle 46: Rehydratisierungslösung Harnstoff 8 M CHAPS 2 % (w/v) Bromphenolblau 0,01 % Für 25 ml Rehydratisierungslösung (RHL) wurde zuerst der Harnstoff bei 37 °C in 10 ml Aqua dest. gelöst, dazu dann CHAPS und Spuren von Bromphenolblau gegeben und auf 25 ml aufgefüllt. Die Rehydratisierungslösung wurde in 1 ml Portionen bei -20 °C gelagert. Vor der Benutzung der Rehydratisierungslösung wurden 54 mM DTE und 0,5 % der entsprechenden Ampholyte-Mischungen (pH- Wert 3-10 oder pH-Wert 5-7) in 1 ml Rehydratisierungslösung gelöst. Material und Methoden 47 Tabelle 47: Programm für die IEF (50 µA/IEF-Streifen (18 cm), 20 °C, pH-Gradient 3-10 oder 4-7 linear) Schritt Volt Schritt-Dauer Rehydratisierung - 12 h 1 500 1 h Step and hold 2 1000 1 h Gradient 3 8000 3 h Gradient 4 8000 2 h Step and hold Tabelle 48: Zusammensetzung des Äquilibrierungspuffers Harnstoff 6 M Tris/HCL (pH 8,8) 0,05 M Glycerol 30 % (w/v) SDS 2 % (w/v) Bromphenolblau 0,01 % (w/v) Um 500 ml Äquilibrierungspuffer herzustellen, wurde der Harnstoff in 200 ml 37 °C warmen Wasser gelöst und mit Tris/HCl (pH 8,8), Glycerol, SDS und Spuren von Bromphenolblau (Tab. 48) supplementiert und mit Aqua bidest. auf 500 ml aufgefüllt. 7.3.3 Färbung von Polyacrylamidgelen Coomassie-Färbung: Die Gele wurden bei Raumtemperatur für 30 min oder über Nacht in Färbelösung (Tab. 49) geschwenkt und dann solange in Entfärber (Tab. 49) wieder entfärbt, bis die Banden im Gel gut sichtbar waren und der Hintergrund nur noch eine schwache Blaufärbung aufwies. Die Gele wurden entweder in 10 %iger Essigsäure aufbewahrt oder in einem Geltrockner (Fa. LBK Amersham-Pharmacia, Freiburg) zwischen zwei Zellophanfolien getrocknet. Material und Methoden 48 Tabelle 49: Lösungen für die Coomassie-Färbung (nach Zehr 1989, modifiziert) Färbelösung 30 % (v/v) Methanol 20 % (v/v) Essigsäure 0,25 % (w/v) Coomassie Blau R 250 ad. Aqua bidest. Entfärber 30 % (v/v) Methanol 10 % (v/v) Essigsäure ad. Aqua bidest. Silberfärbung: Die Silberfärbung wurde nach der Methode von Heukeshoven und Dernick (1988) durchgeführt. Während des ganzen Färbevorganges wurde das Gel geschwenkt. Das Gel wurde zuerst 30 min in Fixierlösung (Tab. 50) fixiert und dann direkt in Inkubationslösung (Tab. 50) überführt, in der es zwischen 30 min und mehreren Stunden inkubiert wurde. Anschließend wurde das Gel fünfmal für 5 min mit Aqua bidest. gewaschen und 2 min in Silbernitratlösung (Tab. 50) inkubiert. Nach kurzem Spülen mit Aqua bidest. wurde es in dem Entwickler (Tab. 50) bis zur gewünschten Färbung inkubiert. Das Gel wurde dann kurz mit Aqua bidest. abgespült und sofort in Stopplösung (Tab. 50) überführt. Nach 25 min wurde das Gel bis zur weiteren Verarbeitung in 10%iger Essigsäure aufbewahrt oder in einem Geltrockner (Fa. LBK Amersham- Pharmacia, Freiburg) zwischen zwei Zellophanfolien getrocknet. Material und Methoden 49 Tabelle 50: Zusammensetzung der Lösungen für die Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1988) Fixierlösung 30 % (v/v) Ethanol 10 % (v/v) Essigsäure Inkubationslösung 30 % (v/v) Ethanol 10 % (v/v) Natrium-Acetat 0,5 % Glutaraldehyd kurz vor der Verwendung hinzugeben 0,2 % Natrium-Thiosulfat kurz vor der Verwendung hinzugeben Silbernitratlösung 0,1 % Silbernitrat 0,2 % Formaldehyd kurz vor der Verwendung hinzugeben Entwickler 2,5 % Natrium-Carbonat 0,01 % Formaldehyd kurz vor der Verwendung hinzugeben Stopplösung 50 mM EDTA 7.4 Agarose-Gelelektrophorese DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese in horizontalen Agarose-Gelen nach Größe aufgetrennt. Für die Auftrennung der DNA-Fragmente wurden Agarosegele mit einer Konzentration von 1 % (w/v) in 1fach TAE-Puffer (Tab. 51) angesetzt. Der Lauf erfolgte bei 100 V in der Mini-Sub Cell GT von Bio-Rad in 1fach TAE-Puffer. Die Proben wurden mit 1/6 Volumen des Auftragspuffers (Tab. 51) versetzt und aufgetragen. Als Längenstandard und zur Abschätzung der DNA-Menge wurde die Gene-RulerTM 1kBp-DNA-Leiter (Fa. MBI Fermentas, St. Leon Rot) verwendet. Die Färbung der Gele erfolgte im Ethidiumbromidbad (Tab.51) für 10 min und anschließendem Entfärben in Wasser. Tabelle 51: Material für die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA 50fach TAE-Puffer 2 M Tris/Essigsäure (pH 8) 0,05 M Natrium-EDTA Auftragspuffer 1 % SDS 0,1 % (w/v) Bromphenolblau 0,1 M EDTA 50 % Glycerol Ethidiumbromidbad 0,5 mg/l Material und Methoden 50 7.5 Identifizierung induzierter Proteine mittels MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption/ionisation - time of flight-mass spectrometry) Induzierte Spots von 2 D-Gelen wurden staub- und kontaminationsfrei ausgeschnitten und in 200 µl 10%ige Essigsäure überführt und von Frau H. Schwaßmann (AG Prof. Dencher, Physikalische Biochemie, TU-Darmstadt) mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Die Proteine wurden hierbei vor der Analyse mit Trypsin verdaut, so dass ein für das entsprechende Protein typisches Massenspektrum gemessen werden kann. Dieses ist oft so spezifisch ist, dass das Protein anhand dieser Information identifiziert werden kann. Unverzichtbar für die Identifizierung eines Proteins ist die schon bekannte Proteinsequenz des entsprechenden Organismus. Für die Identifizierung der induzierten Proteine von Paracoccus sp. IO-1 wurde als Vergleichssequenz die eines sehr nahen Verwandten, Paracoccus denitrificans PD 1222 herangezogen. Das erhaltene Massenspektrum wurde mit dem frei zugänglichen Programm MatrixScience (http://www.matrixscience.com) ausgewertet. 7.6 Reinigung der Isobutyrat-CoA Ligase 7.6.1 DEAE-Sepharose Fast-Flow-Säule (GE Healthcare/ Amersham Bioscience, Freiburg; 15 ml, Innendurchmesser 26 mm) Alle Reinigungsschritte wurden mit einer FPLC-Anlage (Amersham-Pharmacia Biotech, Freiburg) bei 4 °C durchgeführt. Zellextrakte (Aufschluss 1:3 in 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 0,1 % (w/v) DNAse) wurden mittels einer French Press (Kap. III, 5.2) und anschließender Zentrifugation (40000 rpm, 4 °C, 60 min) hergestellt. Der Zellextrakt (5 ml, 250 mg Protein) oder Ammoniumsulfatgefällter und dialysierter Zellextrakt (Kap. III, 6.2.1) wurde auf eine DEAE-Sepharose Fast Flow-Säule aufgetragen, die mit 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTE, 10 %(v/v) Glycerin (Grundpuffer 1) bei einer Flussrate von 5 ml min-1 äquilibriert worden war. Die beladene Säule wurde mit 3 Säulenvolumen Grundpuffer 1 (45 ml) gewaschen. Anschließend wurde mit Elutiospuffer 1 (10 mM Tris/HCl pH 7,5, 2 mM MgCl2, 1 mM DTE, 500 mM KCl, 10 % (v/v) Glycerin; Flussrate 1 ml/min) eine KCl-Stufe von 90 mM und dann ein Gradient über 5 Säulenvolumina (ca. 100 min) eingestellt bis die Endkonzentration von 500 mM KCl erreicht wurde. Die potentielle Isobutyrat-CoA Ligase eluierte unter Material und Methoden 51 diesen Bedingungen bei einer KCl-Konzentration von 250-350 mM. Für die weitere Reinigung der potentiellen Isobutyrat-CoA Ligase wurde eine Reactive- Green-Tropfsäule verwendet. Hierzu wurden Fraktionen mit Isobutyrat-CoA Ligase Aktivität gepoolt und 1:3 mit 10 mM Tris/HCl (pH 7,5) verdünnt. 7.6.2 Reactive-Green-Tropfsäule (Sigma-Aldrich, Taufkirchen); 1 ml; Innendurchmesser 5 mm) Das Säulenmaterial wurde mit Grundpuffer 2 (10 mM Tris/HCl pH 7,5, 2 mM MgCl2) über 10 Säulenvolumina gewaschen und anschließend wurden 3 ml der verdünnten Proteinlösung auf die Säule aufgetragen. Die beladene Säule wurde mit 3 Säulenvolumina Grundpuffer 2 gewaschen. Ein Stufengradient von 200 mM KCl (Grundpuffer 2, 200 mM KCl) führte zur Elution der Isobutyrat-CoA Ligase. Das Eluat wurde in Fraktionen zu je 1 ml aufgefangen und die Aktivität der Isobutyrat-CoA Ligase bestimmt. 7.7 Enzymtest zur Bestimmung der potentiellen Isobutyrat-CoA Ligase Aktivität Die Aktivierung von Isobutyrat zu ihrem korrespondierenden CoA-Thioester durch die CoA Ligase wurde aerob durch einen gekoppelten, spektroskopischen Test durchgeführt. Die Bildung von AMP bei 30 °C wurde durch Zusatz von Myokinase, Pyruvatkinase, Phosphoenolpyruvat und Lactat-Dehydrogenase an die Oxidation von NADH gekoppelt (Ziegler et al. 1987). Der zeitliche Verlauf der Reaktion wurde bei einer Wellenlänge von 365 nm spektrophotometrisch verfolgt (ε365/NADH = 3400 M-1 cm-1). Ein Schema über den Reaktionsverlauf ist in Abb. 9 dargestellt. Material und Methoden 52 Abbildung 9: Gekoppelter, photometrischer Aktivitätstest für die potentielle Isobutyrat-CoA Ligase. PEP (Phosphoenolpyruvat). 8 Analytische Methoden 8.1 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde eingesetzt, um die Substratabnahme von auf Silanol gewachsenen Mikroorganismen zu verfolgen. Auftrennung des radioaktiv markierten DMSD: Die Substratabnahme in den Fütterversuchen mit 14C- markiertem (Kap. III, 4.4) Dimethylsilandiol wurde an der Universität Freiburg in der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. G. Fuchs, an der WATERS 2690-HPLC-Anlage mit einem Durchfluß-Radioaktivitätsmeßgerät (Ramona, Fa. Raytest Isotopenmessgeräte GmbH, Straubenhardt) detektiert. Die Auftrennung der Substanzen erfolgte über eine Carbex II-Säule in H-Form mit Vorsäule (Säule: 250 mm x 8 mm x 9 µm und Vorsäule: 33 x 4,6 mm; Fa. vds- optilab, Berlin). 2 x Lactat Pyruvat 2 x 2 NADH CH3 C = O COO - OH CH3 HC COO - P C C = O COO - O O - O O - 2 x 2 NAD+ Lactat-Deydrogenase PEP AMP + PPi 2 ADP ATP Myokinase Pyruvatkinase Isobutyryl-CoA CoASH Isobutyrat-CoA Ligase ATP CH CH3 CH3 COO - CH CH3 CH3 CO SCoA Isobutyrat Material und Methoden 53 Auftrennung des nicht markierten DMSD: Das nicht markierte DMSD wurde an der HPLC-Anlage in Darmstadt (EliteLaChrom; Autosampler L2200, Pumpe 2130 (VWR Hitachi)) mit derselben Carbex II-Säule in H-Form aufgetrennt und mit einem Ri-Detektor (L-2490, Fa. VWR Hitachi, Darmstadt) detektiert. Zum Nachweis sowohl des radioaktiv markierten wie auch des nicht markierten DMSD wurde folgendes System verwendet: Die Detektion des markierten und nicht markierten DMSD erfolgte unter isokratischen Bedingungen mit einer Pufferzusammensetzung von 0,01 % H3PO4 in Aqua bidest. (Rotisolv® HPLC gradient grade, Fa. Roth, Karlsruhe) mit einer Flußrate von 0,5 ml/min bei Raumtemperatur. Die Elutionszeit für markiertes und nicht markiertes DMSD beträgt 14,7 min. Die bei der HPLC eingesetzten Puffer wurden alle vor Verwendung mit einem 0,2 µm-Filter (MicronSep, Porengröße 0,22 µm, GE Water & Process Technologies) filtriert. Probenvorbereitung: 300 µl der jeweiligen Bakterienkultur wurden steril entnommen und durch Zentrifugation (10 min, 13000 rpm, Raumtemperatur) die Mikroorganismen sedimentiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und über einen Spritzenfilter (0,2 µm x 4mm, PVDF, Fa. vds-optilab, Berlin) filtriert und anschließend 110 µl in ein HPLC-Röhrchen überführt und mittels HPLC analysiert. Auswertung: Die Konzentration des DMSD wurde anhand der Integration der Peaks verfolgt und graphisch dargestellt. 8.2 Nachweis von 14C-CO2 mittels Bariumchlorid-Fällung Beim Wachstum der Kulturen mit DMSD als Substrat sollte dieses vollständig zu CO2 oxidiert werden. Durch die radioaktive Markierung einer Methylgruppe am 14C-DMSD könnte das aus der Oxidation des 14C-DMSD stammende 14C-CO2 durch Bariumchlorid gefällt und anschließend in einem Szintillationszähler (Kap. III, 7.3) detektiert werden. Gefälltes 14C-CO2 müsste im Pellet 2 (s.u.) zu finden sein (Mikrobiologisches Großpraktikum Universität Ulm 1995). Material und Methoden 54 Probenvorbereitung: Von jeder Kultur wurden steril 200 µl (bzw. 1 ml) entnommen und 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert. 100 µl (bzw. 800 µl) des Überstandes (Überstand 1) werden für die Bariumchloridfällung (s.u.) verwendet. Der restliche Überstand wird verworfen und das Pellet (Pellet 1) dreimal mit jeweils 200 µl (400 µl) Aqua bidest. gewaschen und anschließend in 200 µl Aqua bidest. aufgenommen. Davon wurden 100 µl für die Radioaktivitätsbestimmung eingesetzt (Kap. III, 7.3). Bariumchloridfällung: Die Bariumchloridfällung wurde nach dem in Tab. 52 angegebenen Pipettierschema mit dem Überstand 1 (s.o.) angesetzt und 90 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert und der Überstand (Überstand 2) bis zur Radioaktivitätsbestimmung aufbewahrt. Das Pellet (Pellet 2) wurde zweimal mit 200 µl Aqua bidest. gewaschen (Überstand 3 und 4) und dann in 200 µl Aqua bidest. resuspendiert. Von jedem Pellet (Pellet 1 und 2) und jedem Überstand bzw. Waschschritt (Überstand 2, 3 und 4) wurden jeweils 100 µl für die Radioaktivitätsbestimmung verwendet. Tabelle 52: Pipettierschema für die Bariumchloridfällung eines Ansatzes. In Klammern sind die Volumina für die Bariumchloridfällung für Proben des Versuches Kap. III, 5: Isolierung von 14C-DMSD abbauenden Mikroorganismen unter verschiedenen Bedingungen. NH3 (25%ig (v/v)) 8 µl (64 µl) Überstand 1 (s. Probenvorbereitung) 100 µl (800 µl) NH4Cl-Lösung (10%ig (w/v)) 50 µl (400 µl) BaCl2-Lösung (1 M) 100 µl (800 µl) 8.3 Radioaktivitätsbestimmung Die Bestimmung der Radioaktivität erfolgte mit einem Szintillationszähler. Die radioaktiv markierten und Bariumchlorid gefällten Proben (100 µl; Kap. III, 7.2) wurden zu 3 ml Szintillationsflüssigkeit (Rotiszint 2200, Fa. Roth, Karlsruhe) in einem Szintillationsröhrchen (MINIS® 2001 for Minivial Counters, Fa. Zinsser, Frankfurt) gegeben. Die Messung erfolgte über 1 min in einem Szintillationszähler (BETAmatic, Fa. Kontron). Material und Methoden 55 8.4 NMR (nuclear magnetic resonance)-Analyse Die Kernresonanzspektroskopie wurde verwendet, um die Konzentration von nicht markiertem DMSD zu bestimmen. Die Analyse wurde freundlicherweise im Labor von Herrn Dr. M. Amann, Consortium für elektrochemische Industrie, München, durchgeführt. Probenvorbereitung: Für die NMR-Analyse wurden 10 ml einer Bakterienkultur 15 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Analyse verschickt, das Pellet verworfen. 9 Molekularbiologische Methoden 9.1 Isolierung chromosomaler DNA Chromosomale DNA von Paracoccus sp. IO-1 wurde in kleinem Maßstab nach der Methode von Murray und Thompson (1980) isoliert. In ein 1,5 ml Eppendorfgefäß wurden ca. 60 mg gefrorene Zellen eingewogen und in 570 µl TE-Puffer (Tab. 53) resuspendiert. Zu diesem Ansatz wurden 30 µl einer 10%igen SDS-Lösung und 3 µl einer Proteinase K-Lösung (Tab. 53) gegeben, der Ansatz wurde gemischt und 1 h bei 50 °C inkubiert. Um die Salzkonzentration zu erhöhen, wurden 100 µl NaCl-Lösung (Tab. 53) zugefügt. Die Zugabe von 80 µl CTAB/NaCl-Lösung (Tab. 53) bewirkte die Fällung der Zellwand, der denaturierten Proteine und Polysaccharide durch Komplexierung, während die Nukleinsäuren in Lösung blieben. Der Ansatz wurde gemischt und 10 min bei 65 °C inkubiert. Die wässrige Lösung wurde anschließend zweimal mit 700 µl CHCl3/Isoamylalkohol (Tab. 53) extrahiert und je 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und zur Fällung der DNA vorsichtig mit 400 µl Isopropanol überschichtet. Der an der Grenzschicht auftretende DNA-Faden wurde in 200 µl 70%iges (v/v) EtOH überführt und 5 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Der Niederschlag wurde bei 37 °C getrocknet und anschließend in 100 µl TE-Puffer und 10 µl RNase-Lösung über Nacht bei 4 °C gelöst. Zum Nachweis der isolierten DNA wurden 3 µl DNA-Probe mit 3 µl Auftragspuffer (Tab. 51) versetzt und in Material und Methoden 56 einer Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt. Lösungen, die chromosomale DNA enthielten, wurden bei 4 °C aufbewahrt. Tabelle 53: Zusammensetzung der Lösungen für die Isolierung chromosomaler DNA 70 % (v/v) ETOH 70 ml ETOH/100 ml H2O 5 M NaCl 29 g NaCl pro 100 ml H2O 10 % (w/v) SDS 10 g SDS in 100 ml H2O Proteinase K 20 mg Proteinase K in 1 ml TE-Puffer CTAB/NaCl-Lösung 10 % (w/v) CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid); 0,7 M NaCl TE-Puffer 10 mM Tris/HCl pH 8,0; 1 mM Na-EDTA CHCl3/Isoamylalkohol 24:1 (v/v) RNase-Lösung 10 mg/ml RNAse A in TE-Puffer Isopropanol 9.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR ist eine Methode zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten. Oligonukleotide, die vom 5´ bzw. 3´-Ende des zu amplifizierenden Fragments abgeleitet werden, dienen hierbei als Primer für eine thermostabile DNA- Polymerase. Die Methode wurde präparativ zur Amplifizierung von Genen und DNA-Fragmenten eingesetzt. Die PCR-Reaktionen wurden im Mastercycler gradient (Fa. Eppendorf, Hamburg) in 500 µl-PCR-Reaktionsgefäßen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) durchgeführt. Das Endvolumen der Ansätze betrug 100 µl, die Zusammensetzung eines typischen PCR-Ansatzes ist in Tab. 55 gezeigt. Vorbereitung der Proben für die PCR: Je 1 ml Bakterienkultur wurde 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wurde in dem zurückgebliebenen Überstand suspendiert und als Matritze für den Reaktionsansatz verwendet. Alternativ wurde chromosomale DNA isoliert (Kap. III, 8.1) und diese als Matrize eingesetzt. Die verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 54 gezeigt. Material und Methoden 57 Tabelle 54: In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide für PCR-Amplifikationen und Sequenzierungen. Name Sequenz Verwendung F1 5’-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ Sequenzierung 16S rDNA R2 5’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’ Sequenzierung 16S rDNA Fd1 5’CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3’ Amplif