Materialien und Methoden 22 3 Materialien und Methoden 3.1 Materialien Alle Labor- und Feinchemikalien sowie Lösungsmittel in p.a.-Qualität wurden von den Firmen: Fluka, Neu-Ulm Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Sigma, Taufkirchen bezogen. 3.1.1 Mikroorganismen Die Stämme Streptomyces mobaraensis (Nr.: 40847) und Streptomyces coelicolor (Synonym: Streptomyces violaceoruber; Nr.: 40783) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, bezogen. 3.1.2 Materialien zur Herstellung von Nährmedien Agar Merck, Darmstadt Ammoniumsulfat Merck, Darmstadt Calciumcarbonat, gepulvert. p.a. Merck, Darmstadt Calciumchlorid-dihydrat Merck, Darmstadt di-Kaliumhydrogenphosphat, wasserfrei, p.a. Merck, Darmstadt Eisen(III)-citrat Fluka, Neu-Ulm Glucose Merck, Darmstadt Hefeextrakt, granuliert Merck, Darmstadt Kobalt(II)-chlorid Merck, Darmstadt Kupfer(II)-sulfat Merck, Darmstadt Magnesiumsulfat-heptahydrat Merck, Darmstadt Malzextrakt Merck, Darmstadt Mangansulfat Fluka, Neu-Ulm Natriumborat Merck, Darmstadt Natriumchlorid, reinst Merck, Darmstadt Natriummolybdat Fluka, Neu-Ulm Pepton aus Casein, pankreatisch verdaut Merck, Darmstadt Native Kartoffelstärke f. biochem. Zwecke Merck, Darmstadt Zink(II)-chlorid Merck, Darmstadt Materialien und Methoden 23 3.1.3 Enzyme Dispase I (Bacillus polymyxa), > 6 U/mg Roche Diagnostics, Mannheim Trypsin (Rinderpankreas) geb. an Agarose, 24,1 U/ml, TPCK behandelt Sigma, Taufkirchen α-Chymotrypsin (Rinderpankreas) geb. an Agarose 55 U/mg, TLCK behandelt Sigma, Taufkirchen Thermolysin (B. thermoproteolyticus rokko) 36 U/mg Sigma, Taufkirchen 3.1.4 Materialien zur Bestimmung von Endo-Proteaseaktivität Bz-Arg-pNA Sigma, Taufkirchen Cbz-Gly-Pro-pNA Bachem, Heidelberg Cbz-Phe-Arg-pNA Bachem, Heidelberg Cbz-Pro-Phe-Arg-pNA Bachem, Heidelberg Suc-Ala-Pro-pNA Bachem, Heidelberg Suc-Ala-Ala-Phe-pNA Bachem, Heidelberg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Bachem, Heidelberg Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA Sigma, Taufkirchen 3.1.5 Materialien zur Bestimmung von Exo-Proteaseaktivität Ala-pNA Bachem, Heidelberg Leu-pNA Bachem, Heidelberg Phe-pNA Bachem, Heidelberg Pro-pNA Bachem, Heidelberg Ala-Ala-pNA Sigma, Taufkirchen Ala-Phe-pNA Bachem, Heidelberg Ala-Pro-pNA Bachem, Heidelberg Gly-Arg-pNA Bachem, Heidelberg Gly-Glu-pNA Bachem, Heidelberg Gly-Pro-pNA Bachem, Heidelberg Ala-Ala-Ala-pNA Bachem, Heidelberg Ala-Ala-Pro-pNA Bachem, Heidelberg Ala-Ala-Phe-pNA Bachem, Heidelberg Ala-Phe-Pro-pNA Bachem, Heidelberg Pro-Leu-Gly-pNA Bachem, Heidelberg Val-Leu-Lys-pNA Bachem, Heidelberg Ala-Ala-Val-Ala-pNA Sigma, Taufkirchen Ala-Ala-Pro-Leu-pNA Bachem, Heidelberg 3.1.6 Materialien zur Bestimmung von P1’ Endo-Proteaseaktivität FA-Ala-Phe-NH2 Bachem, Heidelberg FA-Gly-Phe-NH2 Bachem, Heidelberg FA-Gly-Leu-NH2 Bachem, Heidelberg Materialien und Methoden 24 3.1.7 Materialien zur Bestimmung von Transglutaminaseaktivität Carbobenzoxy-L-glutaminylglycin (CBZ-Gln-Gly) Bachem, Heidelberg Eisen(III)-chlorid Merck, Darmstadt L-Glutathion (reduziert) Merck, Darmstadt Hydroxylaminhydrochlorid, p.a. Merck, Darmstadt Trichloressigsäure p.a. Merck, Darmstadt Tris, [Tris(hydroxymethyl)aminomethan] Sigma, Taufkirchen 3.1.8 Materialien für elektrophoretische und proteinchemische Verfahren Antibiotika-Testblättchen, ø 6 mm Schleicher und Schuell, Dassel αS-Casein Sigma, Taufkirchen Acrylamid / Bisacrylamid-Lösung, 30 %, 29:1 AppliChem, Darmstadt Agarose AppliChem, Darmstadt Ammoniumperoxodisulfat (APDS) Merck, Darmstadt Anodenpuffer für die IEF pH 3,0 Serva, Heidelberg BCA Proteinbestimmungs-Assay Pierce, Rockford, USA Borsäure Fluka, Neu-Ulm Brilliant Blue R 250 Sigma, Taufkirchen Bromphenolblau Sigma, Taufkirchen Dithiothreitol (DTT) Sigma, Taufkirchen Dialyse-Schläuche Serva, Heidelberg ε-Aminocapronsäure Sigma, Taufkirchen Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Merck, Darmstadt Faltenfilter 595 ½ , ø 185 mm Schleicher und Schuell, Dassel Formaldehyd Merck, Darmstadt Glycerin AppliChem, Darmstadt Harnstoff Merck, Darmstadt IEF-Gele, Servalyt Precotes 3-10 Serva, Heidelberg IEF-Blotgele, Servalyt PreNets 3-10 Serva, Heidelberg Iodessigsäure Sigma, Taufkirchen Marker-Proteinmischung 3-10 für die IEF Serva, Heidelberg Membranen PM-10 Amicon, Danvers, USA Membranfilter (PES) Membrapur, Bodenheim 2-Mercaptoethanol Sigma, Taufkirchen Mikrotiterplatten, Polystyrol Nunc, Dänemark Kathodenpuffer für die IEF, pH 10,0 Serva, Heidelberg Natriumcarbonat Merck, Darmstadt Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg Natriumthiosulfat Merck, Darmstadt Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen 0,2 µm BioRad, München Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V Serva, Heidelberg Saccharose Merck, Darmstadt SDS-Proteinmarker (für die Kapillarelektrophorese) Sigma, Taufkirchen Silbernitrat Merck, Darmstadt Sterilfilter 0,2 oder 0,45 µm Sartorius, Göttingen Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma, Taufkirchen Vorgefärbter LMW-Proteinstandard BioRad, München Materialien und Methoden 25 3.1.9 Materialien für immunchemische Verfahren BCIP / NBT -Substrattabletten Schleicher & Schuell, Dassel Blottingpapier Schleicher & Schuell, Dassel DEAE-Affi-Gel Blue Fertigsäule BioRad, München Glycin AppliChem, Darmstadt Kaninchenserum gegen mikrobielle TGase Eurogentec, Seraing, Belgien Nitrocellulosemembran 0,45 µm Schleicher & Schuell, Dassel Magermilchpulver Fluka, Neu-Ulm Methanol, protein sequencing grade Sigma, Taufkirchen Tween 20 Sigma, Taufkirchen Ziegen IgG, Anti-(Kaninchen IgG)- Konjugat mit Alkalischer Phosphatase Sigma, Taufkirchen 3.1.10 Materialien für chromatographische Verfahren DEAE-Sepharose Sigma, Taufkirchen Fractogel EMD SO3 - 650 (S) Merck, Darmstadt HiLoad 16/60; Superdex 200 prep grade Pharmacia, Uppsala, Schweden HiTrapTM HIC Test Kit (SV je 1 ml): Pharmacia, Uppsala, Schweden - Phenyl-Sepharose High Performance - Phenyl-Sepharose 6 FF (high sub) - Phenyl-Sepharose 6 FF(low sub) - Butyl-Sepharose 4 FF - Octyl-Sepharose 4 FF HiTrapTM IEX Selection Kit (SV je 1ml): Pharmacia, Uppsala, Schweden - SP Sepharose (starker Kationenaustauscher) - CM Sepharose (schwacher Kationenaustauscher) - Q Sepharose (starker Anionenaustauscher) - DEAE Sepharose (schwacher Anionenaustauscher) - ANX Sepharose (schwacher Anionenaustauscher) - Q XL (starker Anionenaustauscher) - SP XL (starker Kationenaustauscher) Arginin Sepharose 4B Pharmacia, Uppsala, Schweden Benzamidin FF (high sub) 1 ml Pharmacia, Uppsala, Schweden Entsalzungssäule HiPrep 26/10 Pharmacia, Uppsala, Schweden Entsalzungs Econo-Pac 10 DC BioRad, München Kalibrierungskit für die GPC Sigma, Taufkirchen 3.1.11 Materialien für Inhibitionsversuche 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid (AEBSF) Sigma, Taufkirchen Aprotinin (Rinderlunge) Sigma, Taufkirchen Bestatin (Hydrochlorid) Sigma, Taufkirchen Benzamidin (Hydrochlorid-Hydrat) Sigma, Taufkirchen Chymostatin Sigma, Taufkirchen Ethylendiamintetraacetat (EDTA, Titriplex III) Merck, Darmstadt Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-tetraacetat (EGTA) Sigma, Taufkirchen DTT Sigma, Taufkirchen Materialien und Methoden 26 Iodacetamid Sigma, Taufkirchen Iodessigsäure Sigma, Taufkirchen Leupeptin Sigma, Taufkirchen o-Phenanthrolin Sigma, Taufkirchen Pepstatin A Sigma, Taufkirchen Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma, Taufkirchen Phosphoramidon ICN Biomedicals, Eschwege N-Tosyl-L-lysin-chlormethylketon (TLCK) Sigma, Taufkirchen Trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4-guanidino)- butan (E-64) Sigma, Taufkirchen Proteaseinhibitor-Cocktail für bakt. Zellextrakte Sigma, Taufkirchen 3.2 Geräte 3.2.1 Kultivierung der Mikroorganismen Vertikaler Autoklav 3870 ELV Tuttnauer, Breda, Niederlande Brutschrank, 80 UL Memmert, Schwalbach Schüttler, B. Braun, LS 30/RO 30 Gerhardt, Bonn Schüttler, KS 10, Bühler Johanna Otto, Hechingen Sicherheitswerkbank Clean Air, Haan Zentrifugen Biofuge A Heraeus Christ, Osterode Suprafuge 22 Heraeus Christ, Osterode 3K30C Sigma Sigma, Osterode 3.2.2 Flüssigkeitschromatographie Einkanal-Monitor UV-1-Kontrolleinheit Pharmacia, Uppsala, Schweden Einkanal-Monitor UV-1-Optische Einheit Pharmacia, Uppsala, Schweden Fraktionssammler, Frac-100 Pharmacia, Uppsala, Schweden Peristaltikpumpe, P-1 Pharmacia, Uppsala, Schweden FPLC-Anlage: Ternäre Pumpe, L6210 Merck/Hitachi, Darmstadt UV-Detektor, L4200 Merck/Hitachi, Darmstadt Fraktionssammler, L5200 Merck/Hitachi, Darmstadt Auftragsschleife, Ultraloop, 90 ml Millipore, Eschborn Chromatographie-Schrank, TC603-1 Tritec, Hannover Schreiber Knauer, Berlin 3.2.3 Konzentrierung von Proteinlösungen Amicon-Zellen, 10, 50 und 150 ml Amicon, Danvers, USA Gefriertrocknungsanlage, ALPHA 2-4 Heraeus Christ, Osterode Ultrafiltrationsröhrchen, Microsep 10k Pall Filtron, Dreieich Materialien und Methoden 27 3.2.4 Bestimmung der Proteinkonzentration und der Enzymaktivität Mikrotiterplattenlesegeräte Steuereinheit, Peacock P 133 professional Asys Hitech, Österreich Software, Mikrowin 3.0 Mikrotek, Overath Genios Tecan, Crailsheim Software, Magelan 2.0 Tecan, Crailsheim Spektralphotometer, Lamda 2 Perkin Elmer, Überlingen Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg 3.2.5 Elektrophoretische Verfahren Mini-Protean II Biorad, München Trans-Blot Semi-Dry Transferzelle Biorad, München Power Supply Pharmacia, Uppsala, Schweden IEF LKB 2117 Multiphor II Pharmacia, Uppsala, Schweden LKB 2197 Power Supply Pharmacia, Uppsala, Schweden Geldokumentationssystem, Image Master®VDS Pharmacia, Uppsala, Schweden 3.3 Kultivierung von Streptomyceten Alle mikrobiologischen Arbeitsschritte erfolgten aseptisch, um Kontaminationen der Kulturen oder die Freisetzung von bakteriellem Material auszuschließen. Die zur Kultivierung verwendeten Medien, nicht sterilverpackte Arbeitsmaterialien sowie alle Rückstände mikrobiellen Materials wurden in feuchter Hitze (20 min bei 121 °C) sterilisiert. Thermolabile Lösungen, wie beispielsweise die Spurenelementlösung nach Voelskow, wurden vor dem Animpfen über einen Sterilfilter (0,2 µm) zum autoklavierten Medium zugegeben. Glaswaren wurden im Trockenschrank bei 160 °C für mindestens 2 h sterilisiert. Die verwendeten Medien, Puffer und Lösungen wurden mit vollentsalztem Wasser (VE-H2O) angesetzt. 3.3.1 Nährmedien 3.3.1.1 GYM-Medium: (Glucose-Yeast-Malt) [Shirling und Gottlieb, 1966] 4 g/1 Glucose 4 g/1 Hefeextrakt 10 g/1 Malzextrakt 2 g/1 CaCO3 Für das Wachstum der Streptomyceten auf Oberflächenkulturen wurden dem GYM-Medium 15 g/1Agar zugegeben (GYM-Platten). Der pH-Wert wurde mit 5 M Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Materialien und Methoden 28 3.3.1.2 Komplexmedium: (Stärke-Mineralsalz-Medium) [Shirling und Gottlieb, 1966] 10 g/1 Stärke 2 g/1 (NH4)2SO4 1 g/1 K2HPO4 1 g/1 MgSO4 x 7 H2O 1 g/1 NaCl 2 g/1 CaCO3 Flüssigkultur-Medium: [Korn-Wendisch und Kutzner, 1981] 20 g/1 Pepton 2 g/1 Hefeextrakt 10 g/1 Glucose in Stärke-Mineralsalz-Medium Der pH-Wert wurde bei beiden Medien mit 5 M Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Spurenelementlösung: [Voelskow, 1989] 4000 mg/1 CaC12 x 2 H2O 1000 mg/1 Fe(III)-citrat x H2O 200 mg/1 MnSO4 100 mg/1 ZnC12 40 mg/1 CuSO4 x 5 H2O 30 mg/1 CoC12 x 6 H2O 30 mg/1 Na2MoO4 x 2 H2O 60 mg/1 Na2B4O7 3.3.2 Kultivierung auf Agarmedien Die Anzucht der Mikroorganismen zur Inokulation von Flüssigmedien, zur Extraktion von Proteasen sowie das Anlegen von Dauerkulturen erfolgte auf GYM-Agarplatten. Ausgehend von einer Reinkultur der DSMZ wurden die Bakterienstämme Streptomyces mobaraensis und Streptomyces coelicolor in sterilem Wasser aufgenommen. Die Suspension wurde mit einer Pipette auf GYM-Platten überführt und mit einem Trigalski-Spatel verteilt. Mittels Reinigungsausstrich wurden die Streptomyceten-Stämme weitere 2-4mal auf neue GYM- Platten überführt. Zur Stammkonservierung wurden die Streptomyceten nach etwa 20 d auf eine neue GYM-Agarplatte überimpft, anschließend mit einem Kunststofffilm verschlossen und bei 28 °C gelagert. Materialien und Methoden 29 3.3.3 Enzymgewinnung aus Agar-Platten Zur Extraktion von Enzymen aus Agar-Platten wurden 24 h bis 60 d alte Festmedienkulturen mit sterilem 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0-8,0, der 1 mM CaCl2 enthielt, überschichtet, mit Kunststofffilm verschlossen und für 24-48 h bei 28-29 °C auf einen Querschüttler (Frequenz 90 pro min) gestellt. Der entnommene Extrakt der Festmedienkultur wurde anschließend mikroskopisch auf Kontaminationen überprüft. Konnte keine Kontamination in den Platten- überständen nachgewiesen werden, so wurde dieser durch Filtration von unlöslichen Stoffen befreit. Die Aufbewahrung der Extrakte der Agarfestmedien erfolgte bei -20 °C. 3.3.4 Enzymgewinnung aus Flüssigmedien Zur präparativen Enzymproduktion wurden 1 Liter Erlenmeyer-Kulturkolben mit 120 ml Flüssigmedium verwendet. Nach dem Autoklavieren der Kulturmedien wurde über einen Sterilfilter (0,2 µm) 1 ml Spurenelementlösung nach Voelskow zugegeben. Anschließend wurde mit einem sterilen Korkbohrer aus einer mit Streptomyces bewachsenen GYM-Agarplatte (> 7 Tage) eine 1 cm2 große Fläche ausgestanzt und damit das Flüssig- medium beimpft. Die Kultivierung erfolgte im Brutschrank bei 28 °C bis zum Erreichen der gewünschten Enzymaktivität. Der Sauerstoffeintrag, der für das Wachstum der aeroben Bakterien benötigt wird, erfolgte durch intensive Bewegung der Flüssigkultur auf einem Rundschüttler mit einer Frequenz von 150 pro Minute. In regelmäßigen Abständen wurden unter sterilen Bedingungen Proben entnommen und Enzymaktivitäten bestimmt. Bei Bedarf wurde das Kulturmedium durch Zentrifugieren und Filtration weitgehend von den Mikroorganismen getrennt, direkt weiter verarbeitet oder bei -20 °C eingefroren. 3.4 Gelelektrophoretische Analyse von Proteinen Die analytische Trennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgte durch diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einem Tris-Glycin-Puffer- system. Aufgrund der besseren Auflösung im Bereich zwischen 10 und 50 kDa wurden Proteine für die Sequenzanalyse mit einen Boratgelsystem getrennt. Die Durchführung aller Gelelektrophoresen fand mit einer Mini-Protean II Apparatur statt. Die Komponenten zur Herstellung der Gele wurden entsprechend der nachfolgend aufgeführten Reihenfolge Materialien und Methoden 30 zusammengegeben und durchmischt. Das Trenngel wurde gegossen und für die Dauer der Polymerisation (mind. 45 min) mit Isopropanol überschichtet. Die Größe der Trenngele betrug ca. 52 x 83 x 0,75-1,5 mm. Analog erfolgte die Präparation des Sammelgels. Nach Einsetzen der Taschenformer und Polymerisation wurden die Gele sofort verwendet oder maximal eine Woche in feuchten Tüchern bei 4 °C aufbewahrt. Die Protein enthaltenden Proben wurden mit dem für das Gelsystem angegebenen Auftragspuffer versetzt und 10 min bei 100 °C denaturiert. Nach Einfüllen des jeweiligen Elektrodenpuffers und Applikation von 2-500 µl der Proben wurden die Proteine bei einer konstanten Spannung von 200 V bzw. von 150 V bei Verwendung des Boratgelsystems getrennt. Mit Auslaufen von Bromphenolblau nach 45 bzw. 180 min wurde die Elektrophorese beendet. Die Proteine wurden anschließend entweder mit Silbernitrat oder Coomassie-Blau angefärbt. Die Zuordnung der Molmasse erfolgte anhand von Markerproteinen. 3.4.1 Analytische Tris-Glycin-Gele [Laemmli, 1970] Die Bedienung der Elektrophoresekammern erfolgte entsprechend der Gerätebeschreibung des Herstellers. Acrylamidlösung: 29,2 % (w/v) Acrylamid 0,8 % (w/v) N,N�-Methylen-Bisacrylamid Elektrodenpuffer: 192 mM Glycin 25 mM Tris-Base 0,1 % (w/v) SDS Auftragspuffer (5x): 4 % (w/v) SDS 40 % (w/v) Glycerin (87 %) 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 0,1 % (w/v) gesät. Bromphenolblaulsg. (wenn gesondert vermerkt, wurde zur Spaltung von Disulfidbrücken 10 % (v/v) 2-Mercaptoethanol zugegeben) Materialien und Methoden 31 Tab. 3-1: Pipettierschema zur Herstellung von SDS-Polyacrylamidgelen. Komponente Trenngel 12,5 % Sammelgel 5 % Acrylamidlösung 5 ml 1,3 ml 1 M Tris-HCl pH 8,9 4,5 ml - 1 M Tris-HCl pH 6,8 - 1 ml Wasser 2,2 ml 5,5 ml 20 % (w/v) SDS 60 µl 40 µl TEMED 10 µl 10 µl 10 % (w/v) APDS 50 µl 50 µl 3.4.2 Boratgele zur Isolierung von Proteinen für die Sequenzanalyse [Poduslo, 1981] Acrylamidlösung: 29,2 % (w/v) Acrylamid 0,8 % (w/v) N,N�-Methylen-Bisacrylamid Elektrodenpuffer: 0,1 M Tris-Base (P1-Puffer, pH 8,3) 0,1 M Borsäure 2,5 mM EDTA 0,1 % (w/v) SDS Gelpuffer : 3 M Tris-Base (P2-Puffer, pH 8,3) 3 M Borsäure 10 mM EDTA 0,4 % (w/v) SDS Sammelgelpuffer: 0,4 M Tris-HCl pH 6,8 0,4 % (w/v) SDS Auftragspuffer: 4 ml P1-Puffer 1 ml gesät. Bromphenolblaulsg. 11 ml bidest. Wasser 5 g Saccharose 2 % (w/v) SDS Materialien und Methoden 32 Tab. 3-2: Pipettierschema zur Herstellung von SDS-Polyacrylamidgelen mit Boratpuffer. Komponente Trenngel 12,5 % Sammelgel 5 % Acrylamidlösung 5,0 ml 1,3 ml Gelpuffer P2 4,5 ml - Sammelgelpuffer - 1,0 ml Wasser 2,2 ml 5,5 ml 20 % (w/v) SDS 50 µl 50 µl TEMED 10 µl 10 µl 12,5 % (w/v) APDS 50 µl 50µl Die im elektrischen Feld getrennten Proteine wurden anschließend mittels Semi-Dry-Blot (3.13.1) auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Proteinbande wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten. Das Gelstück wurde bis zur Sequenzanalyse bei -20 °C eingefroren. 3.4.2.1 Protein-Molekulargewichtsstandards Zur Zuordnung der Molmasse elektrophoretisch getrennter Proteine wurde auf jedes Gel mindestens eine der Spuren mit einem Gemisch von Markerproteinen belegt. Der SDS- Proteinstandard von Sigma wurde bei SDS-Gelen verwendet, deren Proteine durch Silber- oder Coomassiefärbung sichtbar gemacht wurden. Bei der Übertragung von Proteinen nach der Elektrophorese auf Nitrocellulose- oder PVDF-Membranen wurde der vorgefärbte LMW-Marker von BioRad eingesetzt. Die Proteine der beiden Markermischungen sind in den nachstehenden Tabellen aufgelistet. Tab. 3-3: Zusammensetzung des Sigma-SDS-Proteinmarkers (M-2789). Protein Herkunft Molmasse [kDa] Myosin Kaninchenmuskel 205 β-Galactosidase Escherichia coli 116 Phosphorylase B Kaninchenmuskel 97,4 Serumalbumin Rind 66,0 Ovalbumin Hühnerei 45,0 Carboanhydrase Rindererythrocyten 29,0 Trypsininhibitor Sojabohne 20,1 α-Lactalbumin Kuhmilch 14,1 Materialien und Methoden 33 Tab. 3-4: Zusammensetzung des vorgefärbten LMW-Markers der Fa. BioRad (161-0305). Protein Herkunft Molmasse [kDa] Phosphorylase B Kaninchenmuskel 110 Serumalbumin Rind 90,0 Ovalbumin Hühnerei 51,2 Carboanhydrase Rindererythrocyten 36,2 Trypsininhibitor Sojabohne 29,0 Lysozym Hühnerei 21,4 3.4.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) Zur Bestimmung des isoelektrischen Punkts von Proteinen unter nativen Bedingungen wurden eine Horizontalgelelektrophorese-Apparatur und Servalyt Precote-Fertiggele verwendet. In den mit Ampholyten versetzten Gelen bildet sich bei Anlegen eines elektrischen Feldes ein stabiler pH-Gradient aus. Die Proteine wandern entsprechend ihrer Nettoladung zu dem pH-Wert, der ihrem isoelektrischen Punkt entspricht. Anodenpuffer: 0,17 g L-Asparaginsäure (Fertiglösung, Serva) 0,18 g L-Glutaminsäure ad. 50 ml Wasser Kathodenpuffer: 0,22 g L-Arginin (Fertiglösung, Serva) 0,18 g L-Lysin 6 ml Ethylendiamin ad. 50 ml Wasser Nach Temperieren der horizontal angeordneten Kühlplatte auf 4 °C wurde etwa 1 ml Silikonöl gleichmäßig auf der Platte verteilt. Anschließend wurden das Gel, die in Anoden- bzw. Kathodenpuffer getränkten Elektrodendochte sowie der Applikatorstreifen aufgelegt. Zur Verbesserung der Trennschärfe erfolgte vor dem Probenauftrag eine Vorfokussierung. Dazu wurde eine Spannung von 200 V angelegt, die innerhalb von 30 min sukzessive auf 300 V erhöht wurde. 1-50 µl der gegebenenfalls entsalzten Proteinlösungen (Salzkonzentration < 50 mM) wurden anschließend in die Taschen des Applikatorstreifens pipettiert. Die Höchstleistung der Spannungsquelle wurde auf 2 W (für ein Gel der Abmessung 125 mm x 62,5 mm), die Endspannung auf 2000 V begrenzt. Die Fokussierung lief über einen Zeitraum von etwa 3 h. Materialien und Methoden 34 Die Proteine wurden danach mit Silbernitrat gefärbt oder durch Auflegen einer Agarose- Matrix mit Protease-Substraten (3.5.2.1) sichtbar gemacht. 3.4.3.1 Markerproteine für die isoelektrische Fokussierung Die Zuordnung der isoelektrischen Punkte erfolgte anhand einer käuflichen Präparation von Markerproteinen (Tab. 3-5). Tab. 3-5: Zusammensetzung des IEF-Markers 3-10 der Fa. Serva (39211). Protein Herkunft Isoelektrischer Punkt Cytochrom C Pferd 10,7 Ribonuclease A Rinderpankreas 9,5 Lectin Lens culinaris 8,3; 8,0; 7,8 Myoglobin Pferd 7,4; 6,9 Carboanhydrase Rindererythrocyten 6,0 β-Lactoglobulin Kuhmilch 5,3; 5,2 Trypsininhibitor Sojabohne 4,5 Glucoseoxidase Aspergillus niger 4,2 Amyloglucosidase Aspergillus niger 3,5 3.5 Visualisierung von Proteinen 3.5.1 Coomassie-Färbung Die Färbemethode wird bei Proteinkonzentrationen > 0,2 µg pro Bande angewandt. Sie beruht auf einer hydrophoben Adsorption des Farbstoffs Brilliantblau durch die denaturierten Proteine. 3.5.1.1 Färbung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen Die Polyacrylamidgele wurden nach der Elektrophorese 20 min mit der Färbelösung der nachstehenden Zusammensetzung gefärbt. Zur Entfernung von überschüssigem Farbstoff aus dem Gel wurde die Färbelösung durch die Entfärbelösung ersetzt und durch mehrmaliges Waschen solange mit dem Gel inkubiert, bis der Gelhintergrund klar war und die Proteinbanden deutlich sichtbar wurden (etwa 3 h). Materialien und Methoden 35 Färbelösung: 0,25 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 in 45 % (v/v) Ethanol 45 % (v/v) VE-Wasser 10 % (v/v) Eisessig Entfärbelösung: 30 % (v/v) Ethanol 60 % (v/v) VE-Wasser 10 % (v/v) Eisessig 3.5.1.2 Färbung von Proteinen auf PVDF-Membranen [Matsudaira, 1987] Coomassie-Färbung nach der Methode von Matsudaira [1987] erfolgte nach dem Protein- Transfer auf PVDF-Membranen. Die PVDF-Membran mit den immobilisierten Proteinen wurde unmittelbar nach dem Blot in eine Kunststoffschale überführt, 5 min mit der Färbe- lösung behandelt und anschließend solange entfärbt, bis die Proteinbanden deutlich erkennbar waren (2-4 h). Die Membran wurde auf Filterpapier getrocknet, die entsprechenden Protein- Banden wurden für die Proteinsequenzierung mit einem Skalpell ausgeschnitten. Färbelösung: 0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 50 % (v/v) Methanol, sequencing grade Entfärbelösung: 50 % (v/v) Methanol, sequencing grade 3.5.2 Silberfärbung [Blum et al., 1987] Die Methode zeichnet sich durch eine niedrige Nachweisgrenze (ca. 5 ng je Proteinbande, wodurch sie über 40fach empfindlicher ist als die Coomassie-Färbung) und einen hohen Kontrast aus. Bei der Silberfärbung bilden Ag+-Ionen mit den Aminosäureseitenketten Glu, Asp und Cys bei pH-Werten über 10,5 Komplexe aus. Durch den Zusatz von Formaldehyd wird das Ag+ der Komplexe zu metallischem Silber reduziert. Materialien und Methoden 36 3.5.2.1 Färbung von Proteinen in SDS-PAGE- oder IEF-Gelen Ein Polyacrylamid- oder IEF-Gel wurde nach der Elektrophorese in eine Schale überführt und entsprechend Tab. 3-6 behandelt (Reagenzienmenge für ein Gel). Tab. 3-6: Verfahrensschritte zur Anfärbung von Elektrophoresegelen mit Silbernitrat. Schritt Verwendete Lösung Dauer Fixieren Ethanol / Essigsäure / Wasser 50 / 12 / 38 ca. 1 h. Waschen 50 % (v/v) Ethanol 3 x 20 min Vorbehandeln 0,1 g Natriumthiosulfat in 500 ml Wasser 1 min Waschen Wasser 3 x 20 s Imprägnieren 0,4 g Silbernitrat, 100 µl Formalin in 200 ml Wasser 20 min Waschen Wasser 3 x 20 s Entwickeln 8 g Natriumcarbonat, 100 µl Formalinlsg. in 200 ml Wasser bis zur gewünschten Bandenintensität Waschen Wasser 1 x 10 s Stoppen Ethanol / Essigsäure / Wasser 50 / 12 / 38 2 min Die Gele wurden photographiert und anschließend für die weitere Dokumentation zusammen mit Zellophan-Blättern für 30 min in 20 % EtOH und 10 % Glycerin äquilibriert. Die zwischen zwei Zellophan-Blättern getrockneten Gele (Dauer: ca. 4 d) sind unbegrenzt haltbar. 3.6 Immunchemische Methoden 3.6.1 Herstellung polyklonaler TAMEP- und TAMEP-Inhibitor-Antikörper Die Herstellung polyklonaler Antikörper gegen TAMEP und P14 wurde als externe Auftragsarbeit von der Firma Eurogentec, Serain (Belgien) durchgeführt. TAMEP und P14 von S. mobaraensis wurden wie unter 3.12.3 und 3.12.6 beschrieben gereinigt. Entsprechend der empfohlenen Antigenmenge der Firma Eurogentec wurden 400 µg TAMEP und 800 µg P14 mit Auftragspuffer, der zusätzlich 20 mM EDTA und 5 mM Materialien und Methoden 37 PMSF enthielt, um die Eigenhydrolyse auszuschließen, versetzt. Nach der Denaturierung der Proben für 10 min bei 100 °C wurden die Antigene durch SDS-PAGE getrennt. Anschließend wurden die Proteine mit Coomassie gefärbt. Um Essigsäure und Methanol möglichst quantitativ zu entfernen, wurden die Gele für 10 min mit Wasser gewaschen. Die aus- geschnittenen TAMEP- und P14-Banden wurden in jeweils vier gleiche Gelfragmente geteilt und in 1,5 ml Reaktionsgefäße gefüllt und ohne Kühlung an Eurogentec verschickt. Die Immunisierung von zwei Kaninchen mit denaturierter TAMEP und P14 erfolgte nach einem Standardprotokoll. Nach drei Monaten wurden jeweils etwa 60 ml der Antiseren auf Trockeneis geliefert. 3.6.2 Isolierung von IgG aus Kaninchenserum Die polyklonalen Antikörper wurden aus dem Kaninchenserum durch einen Chromato- graphieschritt von Albuminen, Lipoproteinen und Proteasen befreit. Eine DEAE-Affi-Gel Blue Säule ermöglichte die Elution der Immunglobuline G und geringe Mengen an Transferrin ohne Kontamination weiterer Serumproteine. Vor der Chromatographie wurde das Kaninchenserum für 6 h bei 4 °C gegen 28 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl pH 8,0 (Applikationspuffer) dialysiert. Die DEAE-Affi-Gel Säule wurde vor Gebrauch mit 2 M Guanidinium-Hydrochlorid in 40 ml Applikationspuffer (Re- generationspuffer) gewaschen und anschließend mit 80 ml Applikationspuffer äquilibriert. Nach dem Auftrag von 2,75 ml äquilibriertem Kaninchenserum auf die 10 ml Säule wurden die Antikörper mit 20 ml Applikationspuffer eluiert, und Fraktionen von je 1 ml wurden gesammelt. Fraktionen mit einer Proteinkonzentration > 0,5 mg/ml (ca. 10 ml) wurden vereinigt, aliquotiert und bei -20 °C eingefroren. Nach IgG-Isolierung folgte die Elution der gebundenen Serumproteine mit 20 ml Regenerationspuffer, zur Aufbewahrung wurde die Säule mit 20 ml Applikationspuffer mit 0,02 % Natriumazid gespült und bis zur nächsten IgG-Reinigung bei 4 °C gelagert. 3.6.3 Dot-Blot Zur Überprüfung der Antigen-Antikörper-Bindung wurden die gereinigten Antikörper gegen TAMEP und P14 mit den entsprechenden Antigenen durch Dot-Blots untersucht. Hierzu wurden jeweils 2 µl von sieben seriellen Verdünnungsreihen der TAMEP (100 ng-0,8 ng) und des TAMEP-Inhibitors (140-0,5 ng) auf eine Nitrocellulosemembran pipettiert. Nach dem Materialien und Methoden 38 Trocknen an der Luft wurden die Membranen mit den TAMEP- bzw. P14-Proben in jeweils sieben identische Streifen geschnitten und in insgesamt vierzehn Kunststoffschalen überführt. Die immunchemische Färbung (3.6.5) erfolgte mit seriellen Erstantikörperverdünnungsreihen der TAMEP und des TAMEP-Inhibitors von 1 : 100 bis 1 : 20000 in TBST-Puffer (TBST- Puffer, siehe 3.6.5). 3.6.4 Western-Blot Mit dieser Methode werden Proteine, die durch SDS-Gelelektrophorese getrennt wurden, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Die auf der Membranoberfläche adsorbierten Proteine sind für Antikörper zugänglich. Der Proteintransfer auf die Membran erfolgte mittels einer Semi-Dry Blot Apparatur mit Platin / Edelstahl-Elektroden und dem Transferpuffer- System von Towbin et al. [1979]. Transferpuffer: 48 mM Tris-Base 39 mM Glycin 1,3 mM SDS 20 % (v/v) Methanol sequencing grade; pH 9,1 Nach Beendigung der Elektrophorese wurde bei SDS-Polyacrylamidgelen das Sammelgel entfernt und das Trenngel 5 min in Transferpuffer äquilibriert. Vier Filterpapiere sowie die Nitrocellulosemembran wurden auf Gelgröße zugeschnitten und in Transferpuffer getränkt. Der Aufbau erfolgte von unten nach oben, beginnend auf der Anode der Semi-Dry- Blotapparatur (Abb. 3-1). Kathode der Semi-Dry-Blotapparatur 2 in Transferpuffer getränkte Blotpapiere In Transferpuffer äquilibriertes Trenngel In Transferpuffer äquilibrierte Nitrocellulosemembran 2 in Transferpuffer getränkte Blotpapiere Anode der Semi-Dry-Blotapparatur Abb. 3-1: Aufbau einer Western-Blot-Anordnung für den Spannungs-induzierten Proteintransfer von einem Elektrophoresegel auf eine Nitrocellulosemembran. Materialien und Methoden 39 Der Proteintransfer auf die Membran erfolgte bei einer konstanten Spannung von 20 V. Nach 45 bis 60 min wurde die Membran in eine Kunststoffschale der Abmessung 7 x 13 cm überführt, mit Wasser gewaschen und immunchemisch gefärbt. 3.6.5 Immunchemische Färbung Der Nachweis von immobilisierten Antigenen nach Western- bzw. Dot-Blots erfolgt mittels spezifischer Antikörper. Die Erstantikörper wurden danach durch enzymkonjugierte Zweit- antikörper gebunden und durch einen präzipitierenden Farbstoff sichtbar gemacht. TBST-Puffer 10 mM Tris-HCl pH 8,0 150 mM NaCl 0,05 % (v/v) Tween 20 TBST-Blotto: 2,5 g Magermilchpulver in 50 ml TBST Erstantikörperlösung: 2 µl gereinigte IgG gegen BTGase in 30 ml TBST oder 7,5 µl gereinigte IgG gegen P14 in 30 ml TBST oder 50 µl gereinigte IgG gegen TAMEP in 30 ml TBST Zweitantikörperlösung: 2 µl Anti-(Kaninchen-IgG)-IgG aus Ziege, in 30 ml TBST AP-Puffer: 100 mM Tris-HCl pH 9,5 100 mM NaCl 5 mM MgCl2 Substratlösung: ½ BCIP / NBT-Tablette in 15 ml bidest. Wasser Stopppuffer: 20 mM Tris-HCl pH 8,0 5 mM EDTA-NaOH pH 8,0 Die immunchemische Färbung immobilisierter Proteine ist nachfolgend tabellarisch aufgeführt: Materialien und Methoden 40 Tab. 3-7: Verfahrensschritte zur Anfärbung von Proteinen auf Nitrocellulosemembranen. Schritt Lösung Zeit Waschen TBST 3 x 5 min Sättigen TBST-Blotto 60 min Waschen TBST 3 x 5 min Erstantikörperbindung Erstantikörperlösung 90 min Waschen TBST 3 x 5 min Zweitantikörperbindung Zweitantikörperlösung 90 min Waschen TBST 3 x 5 min Aquilibrieren AP-Puffer 1 min Farbreaktion Substratlösung bis zur gewünschten Bandenintensität Stoppen Stoppuffer 1 min Waschen Wasser 1 min Die angefärbte Membran wurde zwischen zwei Filterpapieren getrocknet, dokumentiert und unter Lichtausschluss aufbewahrt. 3.7 Konzentrieren, Entsalzen und Teilreinigen von Proteinlösungen 3.7.1 EtOH-Fällung Protisch, dipolare Lösungsmittel wie Ethanol setzen die Löslichkeit von Ionen (Salze, Proteine) im wässrigen Milieu aufgrund ihrer niedrigen Dielektrizitätskonstante herab. Die Ethanolfällung wurde zur Aufkonzentrierung von Proteinen bzw. zum Umpuffern verwendet. Um die Denaturierung der Proteine durch Ethanol zu verringern, wurde die Fällung in einem Eisbad durchgeführt. Unter ständigem Rühren wurde zu dem vorgekühlten Kulturmedium oder der Proteinlösung langsam Ethanol (-20 °C) bis zu einer Volumenkonzentration von 70 Prozent zugegeben. Der durch Zentrifugieren (10000 x g, 15 min, 4 °C) erhaltene Nieder- schlag wurde anschließend im gewünschten wässrigen Puffersystem aufgenommen. Materialien und Methoden 41 3.7.2 Ammoniumsulfat-Fällung Durch die Zugabe von Salzionen mit hoher Ionenstärke wird die Löslichkeit von Proteinen herabgesetzt. Die Salzionen entziehen einem Protein solange die Wassermoleküle, die es für die Solvatation benötigt, bis es unlöslich wird und ausfällt. Die Ammoniumsulfat-Fällung (AS-Fällung) wurde zur Konzentrierung von Proteinlösungen angewendet, oder es wurde eine fraktionierende AS-Fällung durchgeführt, die zur Teilreinigung des gesuchten Proteins führen konnte. Die hierbei angewendeten Ammonium- sulfat-Konzentrationen für die Fällung von Proteinen bei 0 °C wurden Dawson et al. (1955) entnommen (Abb. 3-2). % Endsättigung / 20 30 40 50 60 70 80 0 107 166 229 295 366 442 523 20 56 115 177 244 316 392 30 57 119 184 253 328 40 59 122 190 262 50 61 127 197 60 63 131 % A us ga ng ss ät tig un g 70 66 Abb. 3-2: Ammoniumsulfatmengen in g/l zur Herstellung definierter Prozentgehalte bei 0 °C nach Dawson et al. (1955). Die AS-Fällung wurde in einem Eisbad durchgeführt. Bei der fraktionierenden AS-Fällung wurde die Salzkonzentration stufenweise in der Regel um 10 Prozent erhöht. Zur Vermeidung lokaler Übersättigung wurden dabei nur kleine Mengen AS zugegeben. Ausgefallene Proteine wurden durch Zentrifugieren (10000 x g, 15 min, 4 °C) sedimentiert, erneut in Puffer gelöst oder verworfen. Die AS-Konzentration im Überstand wurde unter Berücksichtigung der Volumenzunahme solange weiter erhöht, bis das Zielprotein ausgefallen war. 3.7.3 Ultrafiltration Die Ultrafiltration wie auch die Druckfiltration (s.u.) ermöglicht die Entfernung niedermolekularer Substanzen sowie die Konzentrierung von Proteinlösungen. Die Proben mit einem Volumen bis zu 3,5 ml wurden in Microsep 10K Röhrchen gegeben und bei 3000- 7500 x g (4 °C) durch die Membran mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDa gedrückt. Materialien und Methoden 42 Durch alternierende Zugabe von Puffer und Zentrifugation wurde die Ausgangslösung umgepuffert, entsalzt und bis auf ein Volumen von 35-50 µl eingeengt. 3.7.4 Druckfiltration Die Druckfiltration wurde mit Amicon-Zellen (10, 50 und 150 ml) unter Rühren und Eiskühlung durchgeführt. Proteinlösungen wurden mit Stickstoff durch eine semipermeable Membran, die in das Bodenstück der Apparatur eingesetzt wurde, gepresst. Der Druck betrug 3,0 bis 3,5 bar, die PES-Membran hatte ein Ausschlussvolumen von 10 kDa. 3.7.5 Lyophilisation Die Lyophilisation (Gefriertrocknung) ermöglicht die schonende Konzentrierung von Proteinlösungen. Im Vakuum wird einer Proteinprobe Wasser durch Sublimation entzogen. Vor der Gefriertrocknung wurde die Probe bei -20 °C eingefroren. Bei einer Eiskondensator- Temperatur von -70 bis -80 °C, einem Druck von 0,04-0,08 mbar und einer Stellflächen- temperatur von -10 bis -6 °C wurden Proteinproben von 100 µl bis 100 ml bis zum gewünschten Volumen eingeengt oder getrocknet. 3.7.6 Dialyse Die Abtrennung von hydrophilen Verunreinigungen und Salzen erfolgte auch durch Dialyse. Hierzu wurden Dialyse-Schläuche (MWCO 6000-8000) vor ihrem Gebrauch in dest. Wasser mit 10 mM EDTA gekocht und anschließend mehrfach mit dest. Wasser gespült. Die Aufbewahrung vorbehandelter Schläuche erfolgte in EtOH (20 % (v/v)) bei 4 °C. Die Dialyse wurde bei 2-3 maligem Pufferwechsel bei 4 °C für die Dauer von 4-6 h oder über Nacht durchgeführt. 3.7.7 Entsalzen mittels GPC Für die Entsalzung von Proteinlösungen oder von Seren wurden auch Entsalzungssäulen verwendet. Die Gelfiltration ermöglicht die schnelle und einfache Trennung von Proteinen (Molmasse > 6000 Da) und niedermolekularen Substanzen, insbesondere von Salzen. Bei größeren Volumina wurde eine 2,6 cm x 10 cm HiPrep-Säule 26/10 gefüllt mit Sephadex G-25 F (Bettvolumen: 53 ml) der Fa. Pharmacia verwendet, bei kleineren Volumina eine Materialien und Methoden 43 Econo Pac 10 DC-Säule (Bettvolumen: 10 ml) der Fa. BioRad. Die Fließgeschwindigkeiten betrugen 6 ml/min bzw. 1 ml/min. HiPrep-Chromatographie wurde mit der FPLC-Anlage (Merck/Hitachi) durchgeführt. Vor dem Probenauftrag (< 70 mg/ml Proteine) wurde die Säule mit 100 bis 150 ml Puffer äquilibriert. Die erhaltenen 6 ml Fraktionen wurden mittels Aktivitätstest und SDS-PAGE überprüft. Auf Econo-Pac 10 DC-Entsalzungssäulen äquilibriert mit 20 ml eines beliebigen Puffers, wurden die Proteinlösungen bis zum vollständigen Einlauf in das Gelbett aufgegeben. Anschließend wurden die Proteine mit Puffer eluiert, wobei manuell 1-1,5 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Ermittlung der Protein enthaltenden Fraktionen erfolgte entweder durch Bestimmung der Aktivität oder SDS-PAGE. 3.8 Molekulargewichtsbestimmungen 3.8.1 SDS-PAGE Markerproteine und die Probe mit unbekanntem Molekulargewicht wurden mittels SDS- PAGE getrennt. Durch halblogarithmische Auftragung der bekannten Molekurgewichte der Eichproteine gegen die Laufstrecken wurde das unbekannte Molekulargewicht der Probe ermittelt. 3.8.2 Gelpermeationschromatographie Die Bestimmung des Molekulargewichtes erfolgte mit einer 1,6 cm x 60 cm Hiload 16/60 GPC-Säule mit Superdex 200 prep grade (Bettvolumen: 120 ml) bei einer Flussrate von 1 ml/min. Als Laufpuffer wurde 150 mM NaCl und 2 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl pH 7,0 oder pH 8,0 verwendet. Zur Kalibrierung wurde eine Mischung der in Tab. 3-8 aufgelisteten Proteine vor der eigentlichen Probe getrennt. Die halblogarithmische Auftragung der Molekulargewichte der Eichproteine gegen die Retentionszeiten lieferte die unbekannte Molmasse der Probe. Materialien und Methoden 44 Tab.3-8: Eichproteine zur Bestimmung des Molekulargewichts durch Gelpermeationschromatographie Marker-Proteine Herkunft Molekularmasse [kDa] Blue Dextran 2000 Thyroglobulin Rind 669 Apoferritin Pferdemilz 443 β-Amylase Kartoffel 200 Alkohol-Dehydrogenase Saccharomyces cerevisiae 150 Albumin Rind 66 Carboanhydrase Rindererythrocyten 29 Cytochrom C Rinderherz 12,4 Die GPC-Säule wurde mit 0, 2 M NaOH gereinigt und mit 20 % (v/v) Ethanol konserviert. 3.9 Bestimmung der Proteinkonzentration [Smith et al., 1985] Die Bestimmung der Proteinkonzentration in wässrigen Lösungen erfolgte nach der Bicinchoninsäure-Methode von Smith et al. [1985]. Proteine reduzieren in alkalischer Lösung Kupfer(II)- zu Kupfer(I)-Ionen. Dafür sind in erster Linie Cystein, Cystin, Tyrosin, Tryptophan und Peptidbindungen verantwortlich. Die einwertigen Kupferionen bilden in Gegenwart von Bicinchoninsäure (BCA) einen violettfarbenen Komplex, dessen Extinktion mit der Proteinkonzentration korreliert. Der BCA-Test wurde in Anlehnung an Sorensen und Brodbeck [1986] sowie Redinbaugh und Turley [1986] in Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Testlösung setzt sich aus den bei der Firma Pierce erhältlichen Reagenzien zusammen: Reagenz A: 1 % (w/v) Bicinchoninsäure, Dinatriumsalz 2 % (w/v) Natriumcarbonat 0,16 % (w/v) Natriumtartrat 0,4 % (w/v) Natriumhydroxid 0,95 % (w/v Natriumhydrogencarbonat mit Natronlauge auf pH 11,25 eingestellt Reagenz B: 4 % (w/v) Kupfersulfat Testlösung: Reagenz A : Reagenz B = 50 : 1 Materialien und Methoden 45 Zu 25 µl der zu analysierenden Proteinlösung sowie je 25 µl einer BSA-Verdünnungsreihe (1,0; 0,6; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 mg/ml) wurden 200 µl der Testlösung in die Vertiefung der Mikrotiterplatten gegeben, mit einer Kunststofffolie abgedeckt und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Unmittelbar danach erfolgte die Messung der Absorption des Farbkomplexes bei einer Wellenlänge von 550 nm. Nach Abzug des Referenzwerts (entsprechende Puffer) wurde mit den Werten der BSA-Verdünnungsreihe durch das Genios-Programm des Lesegeräts eine Eichgerade erstellt und die Proteinkonzentration der Probe ermittelt. 3.10 Bestimmungen der Enzymaktivität von Transglutaminasen [Grossowicz et al., 1950] Grundlage zur Bestimmung der Aktivität von bakteriellen Transglutaminasen bildet der enzymkatalysierte Einbau von Hydroxylamin in das synthetische Substrat Carbobenzoxy- L-glutaminylglycin (CBZ-Gln-Gly). Die an der Glutamyl-Seitenkette des Peptidderivats gebildete Hydroxamsäure wird mit Eisen(III)-Ionen komplexiert und photometrisch quantifiziert. Reagenz 1: 0,1 M Hydroxylamin 10 mM Glutathion 30 mM CBZ-Gln-Gly in: 0,2 M Tris-Acetat pH 6,0 Reagenz 2: Entsprechend der Anzahl zu analysierender Proben wurden gleiche Volumina von 12 % (w/v) HCl 5 % (w/v) FeCl3 in 0,1 M HCl 12 % (w/v) CCl3COOH gemischt. 3.10.1 Bestimmung der TGase-Aktivität in 1,5 ml Reaktionsgefäßen Die Durchführung der Analyse erfolgte nach dem Pipettierschema von Abb. 3-3 Die Bestimmung der Transglutaminaseaktivität in Kulturmedien erforderte aufgrund der teilweise intensiven Eigenfärbung die zusätzliche Messung eines Probenblindwerts. Die Zugabe des stark sauren Reagenzes 2 vor der Probelösung inhibiert die enzymatische Reaktion, so dass ausschließlich die Absorption der Eigenfärbung bestimmt wird. Die Enzymaktivität berechnet sich entsprechend aus der Extinktionsdifferenz von Probe und Blindproben. Materialien und Methoden 46 Reagenzienblindwert Probenblindwert (bei Bestimmung der Enzymaktivität in Kulturmedien) Probenwert Inkubationsansatz 550 µl Reagenz 1 500 µl Reagenz 1 500 µl Reagenz 2 500 µl Reagenz 1 Temperieren 10 min bei 37 °C Reaktionsstart durch Zugabe von - 50 µl Probelösung 50 µl Probelösung Inkubation 10 min bei 37 °C Termination 500 µl Reagenz 2 - 500 µl Reagenz 2 Zentrifugation zum Abtrennen von prä- zipitierten Proteinen 5 min, 10.000 x g Bestimmung der Extinktion gegen den Referenzwert unmittelbar im Anschluß bei λ = 525 nm Abb. 3-3: Pipettierschema zur Bestimmung von Transglutaminase in 1,5 ml Mikroküvetten. Die Enzymaktivität der Transglutaminasen ist definiert als: 1 U 1 mol gebildete Hydroxamsäure min = µ Die Volumenaktivität der Probenlösung berechnet sich aus der Konzentration der gebildeten Hydroxamsäure bzw. aus der gemessenen Extinktionsdifferenz. tvd VEivität Volumenakt ⋅⋅⋅ ⋅∆= ε mit ∆E Extinktionsdifferenz zwischen Proben- und Kontrollwert bzw. Referenzwert V Gesamtvolumen ( 1,05 ml) ε Extinktionskoeffizient Eisen(III)-Glutamylhydroxamat (0,470 ml / µmol cm) d Schichtdicke der Küvette (1 cm) v Probenvolumen (50 µl) t Reaktionszeit (10 min) Materialien und Methoden 47 Einsetzen der aufgeführten Größen ergibt aus der gemessenen Extinktionsdifferenz direkt die Volumenaktivität: Volumenaktivität U ml     525nm = ∆E ⋅ 4.47 µmol mlmin⋅     3.10.2 Bestimmung der TGase-Aktivität in Mikrotiterplatten Die Durchführung des Hydroxamat-Tests in Mikrotiterplatten ermöglicht die Einsparung von Reagenzien und die Ermittlung der TGase-Aktivität von bis zu 96 Proben mit einer Messung. Die Bestimmung der TGase-Aktivität mit Mikrotiterplatten stellte die Grundlage für die Etablierung eines Transglutaminase-Aktivierungstests (3.11.2) dar. Reagenzienblindwert Probenblindwert (bei Bestimmung der Enzymaktivität in Kulturmedien) Probenwert Inkubationsansatz 100 µl Reagenz 1 100 µl Reagenz 1 100 µl Reagenz 2 100 µl Reagenz 1 Temperieren 10 min bei 37 °C Reaktionsstart durch Zugabe von - 50 µl Probelösung 50 µl Probelösung Inkubation 10 min bei 37 °C Termination 100 µl Reagenz 2 - 100 µl Reagenz 2 Bestimmung der Extinktion gegen den Referenzwert Messung bei λ = 492 nm Abb. 3-4: Pipettierschema zur Bestimmung von Transglutaminase-Aktivität in Mikrotiterplatten. Materialien und Methoden 48 Für die Messungen der Transglutaminaseaktivität in Mikrotiterplatten wurde mit Glutaminsäure-γ-monohydroxamat bei einer Wellenlänge von 492 nm und einem Volumen von 200 µl ein molarer Extinktionskoeffizient von 50,15 ml/mmol ermittelt. tv VEivität Volumenakt 200 492 ⋅⋅ ⋅∆= lµε mit ∆E Extinktionsdifferenz zwischen Proben- und Kontrollwert bzw. Referenzwert V Gesamtvolumen (250 µl) ε Extinktionskoeffizient Eisen(III)-Glutamylhydroxamat (0,05015 ml/µmol) v Probenvolumen (50 µl) t Reaktionszeit (10 min) Analog zu 3.10.1 errechnet sich durch Einsetzen der aufgeführten Größen und aus der gemessenen Extinktionsdifferenz mit dem Mikrotiter-Messgerät die Volumenaktivität: Volumenaktivität nm492ml U     = ∆E ⋅ 9,97     ⋅mlmin molµ 3.10.3 Bestimmung der TGase-Aktivität auf bewachsenen Agar-Platten Eine auf Agarfestmedium angezogene Streptomyces mobaraensis Kultur wurde mit 1,0 ml Reagenz 1 (siehe 3.10) versetzt und 10 min bei 37 °C inkubiert. Nach der Entnahme des Überstandes wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,0 ml Reagenz 2 (siehe 3.10) abgestoppt. 250 µl der überstehenden Lösung wurden am MTP-Reader bei 492 nm gemessen. Die Berechnung erfolgt wie unter 3.10.2 beschrieben. Bei der Messung der Transglutaminase- aktivität diente eine unbewachsene GYM-Platte als Probenblindwert. 3.11 Methoden zur Bestimmung von Proteaseaktivität 3.11.1. Proteinverdauungstest für Metalloproteasen auf SDS-Gelen In Anlehnung an Raser et al. [1995] kann die hydrolytische Aktivität von Proteinen gegen Casein oder Gelatine direkt nach elektrophoretischer Trennung mit SDS-Gelen nachgewiesen werden. Dieser Test findet bei Metalloproteasen Anwendung (Nachweisgrenze 2-10 ng), die im Gegensatz zu anderen Proteasen die denaturierenden Bedingungen oft überstehen. SDS- Materialien und Methoden 49 sensitive Proteasen müssen zuvor unter nicht-denaturierenden Bedingungen getrennt werden. Für den Nachweis der Metalloproteasen wurden die Gele entsprechend 3.4.1 hergestellt mit der Ausnahme, dass in das Trenngel zusätzlich 0,2 % (w/v) αS-Casein einpolymerisiert wurde. 15 µl der Protease-enthaltenden Proben wurden mit 5 µl Auftragspuffer aus 10 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) Glycerin, 0,004 % (w/v) Bromphenolblau und 200 mM Tris-HCl, pH 6,8 gemischt und ohne Erhitzen in die Taschen des Polyacrylamidgels pipettiert. Nach der Elektrophorese mit Elektrodenpuffer (192 mM Glycin, 25 mM Tris-Base und 0,1 % (w/v) SDS ) wurde das Gel in Renaturierungspuffer P1 aus 2,5 % (v/v) Triton X-100 und 100 mM Glycin, pH 8,3, ca. 3 h bei 2-3fachem Pufferwechsel bei Zimmertemperatur gewaschen. Nach Inkubation in Proteolysepuffer P2 aus 2 mM CaCl2, 100 mM Glycin pH 8,3 (ggf. 1 mM ZnCl2) bei 28 °C für 8-20 h (zwei bis drei Pufferwechsel) wurde das Gel mit Wasser bei zweifachem Wechsel 15 min gewaschen und anschließend Coomassie gefärbt. Eine im Gel befindliche stabile Protease hydrolysiert das eingebettete Casein. Coomassie-Färbung ermöglicht die Identifizierung der Protease durch Unterscheidung eines proteinfreien, farblosen Flecks von der blau gefärbten Gel-Umgebung. 3.11.2 Transglutaminase-Aktivierungstest 20 µl ProTGase (0,37 mg/ml) wurden in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte pipettiert und mit 40 µl Dispase (0,1-100 µg/ml) und 2 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 oder 20 µl Probe und 30 µl Puffer gemischt und 30 min bei 28 °C inkubiert. In den Kontrollansätzen wurde anstelle von Dispase oder Probe Puffer verwendet. Zusätzlich wurden nach Ablauf der Reaktionszeit 10 µl bzw. 20 µl des Gemischs entnommen und via SDS-PAGE charakterisiert. Zu den verbliebenen 50 µl wurden 100 µl Reagenz 1 (siehe 3.10) pipettiert, vermischt und weitere 10 min bei 37 °C inkubiert. Die Transglutaminase-Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl Reagenz 2 (3.10) beendet, und die Absorption des entstandenen roten Eisen(III)- hydroxamat-Komplexes wurde mit dem Genios Multifunktions-Lesegerät bei 492 nm ermittelt. Die Transglutaminase-Aktivität wurde, wie unter 3.10.2 beschrieben, berechnet. Materialien und Methoden 50 Mit einer spez. Transglutaminase-Aktivität von 36 U/mg lässt sich die TAMEP-Aktivität wie folgt berechnen: min30 U/mg36 g/mol 42500 10 x U/ml ivität Volumenakt 3 ⋅⋅ ⋅ = −     ⋅mlmin molp mit: x U/ml gemessene TGase-Aktivität im TGase-Aktivierungstest 42500 g/mol ermittelte Molmasse der ProTGase 36 U/mg spezifische Aktivität der TGase 30 min Inkubationszeit Einsetzen der aufgeführten Größen ergibt aus der gemessenen TGase-Aktivität in Mikrotiterplatten direkt die Volumenaktivität: Volumenaktivität     ml U = min10 45,9 x U/ml 9⋅     ⋅mlmin molp 3.11.3 Bestimmung von Proteaseaktivität mit p-Nitroanilid-Derivaten Durch die enzymatische Hydrolyse der Amidbindung von farblosen Peptidyl-4-nitroaniliden wird gelbes para-Nitroanilin abgespalten. Die Freisetzung des Farbstoffs kann durch kontinuierliche Messung der Absorption bei 405 nm photometrisch verfolgt werden. Für die Messungen in 96-Well-Mikrotiterplatten wurde ein molarer Extinktionskoeffizient von 4.642,9 ml/mmol mit para-Nitroanilin für ein Gesamtvolumen von 200 µl pro Kavität ermittelt. Zur Bestimmung der Volumenaktivität wurden 100 µl Substratlösung (0,4 mM) mit bis zu 20 % (v/v) DMSO, EtOH oder MeOH vorgelegt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl Proteaselösung gestartet, und bei 28 °C wurde der Anstieg der Absorption für 20 min gemessen. Die Volumenaktivität errechnete sich wie folgt: Volumenaktivität =         = ∆ ∆ − ml U ml nmol t E v V l 3200 405 10*min* * *µε Materialien und Methoden 51 mit ∆E/∆t lineare Extinktionszunahme pro Zeiteinheit in [min] V Gesamtvolumen (200 µl) v Probenvolumen (100 µl) ε Extinktionskoeffizient von p-Nitroanilin (4.642,9 ml/mmol) Eine Enzymeinheit [U] entspricht der Proteasenmenge, die unter den gewählten Reaktions- bedingungen die Bildung von 1 nmol p-Nitroanilin pro min katalysiert. Einsetzen der aufgeführten Größen ergibt aus der gemessenen linearen Extinktionszunahme pro Zeiteinheit direkt die Volumenaktivität: Volumenaktivität nm405ml U     = ∆E/∆t ⋅ 430,76     ⋅ mlmin moln 3.11.4 Bestimmung von Proteaseaktivität mit Furylacryloylpeptidyl-Derivaten Eine einfache photometrische Bestimmung von Proteasen mit P1�-Spezifität ist mit Furylacryloylpeptiden möglich. Diese Verbindungen haben ihr Absorptionsmaximum bei 337 nm, durch die Hydrolyse wird die Intensität der Absorption vermindert. Die Abnahme der Extinktion wird üblicherweise bei 340 nm gemessen. Für die Bestimmung der Proteasenaktivität in Mikrotiterplatten wurden zuvor die Extinktionskoeffizienten für ein Gesamtvolumen von 200 µl pro Kavität von 608 ml/mmol (FAAFA), 527 ml/mmol (FAGFA) und 389 ml/mmol (FAGLA) ermittelt. Die Volumenaktivität für die Hydrolyse der FA-Substrate errechnet sich aus dem linearen Bereich der Absorptionsabnahme pro Zeiteinheit wie folgt: Volumenaktivität =         = ∆ ∆− − ml U mlt E v V l 3200 340 10*min* mol* * µ ε µ mit ∆E/∆t Extinktionsabnahme pro Zeiteinheit im linearen Bereich V Gesamtvolumen (200 µl) v Probenvolumen (1-10 µl) ∆ε340 FAAFA: - 608 ml/mmol; FAGFA: - 527 ml/mmol, FAGLA: - 389 ml/mmol bei einer Substratkonzentration von 0,5 mM Materialien und Methoden 52 Eine Enzymeinheit [U] entspricht der Proteasekonzentration, die unter den gewählten Reaktionsbedingungen die Hydrolyse von 1 µmol Furylacryloyl-Peptid pro min katalysiert. Methode a: 30 µl Protease-Probe wurden zu 160 µl 2 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,0 in die Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl eines FA-Substrats (10 mM) in DMSO gestartet. Die Messung der Abnahme der Absorption bei 340 nm fand für eine Dauer von 20 min bei Zimmertemperatur statt. Methode b: Die Enzymkonzentration wurde so gewählt, dass die Messung nur im linearen Bereich bei 340 nm erfolgte. Hierzu wurden 170-180 µl Tris-MES-Puffer in den Vertiefungen der Mikrotiterplatten auf 37 °C temperiert, mit 1-10 µl Enzymlösung gemischt und die Reaktion mit 10 µl eines Furylacryloyl-Substrats (10 mM in DMSO) gestartet. Die Absorptionsabnahme bei 340 nm wurde für 20 min bei 37 °C mit dem Genios-MTP-Lesegerät gemessen. 3.11.5 Spezifischer Nachweis von Proteaseaktivitäten in IEF-Gelen Durch Auflegen eines Agarosegels mit Proteasesubstraten (meist Casein) auf ein IEF-Gel kann eine gesuchte Protease und ihr isoelektrischer Punkt ermittelt werden. Zur spezifischen Identifizierung von TAMEP und der Peptidyl-Aminopeptidase wurde eine Casein- konzentration von 0,2 mg/ml bzw. eine Ala-Pro-pNA-Konzentration von 0,3 mg/ml in der Agarosematrix gewählt. Die Substrat-Gele wurden nach dem Abkühlen luftblasenfrei auf die IEF-Gele gelegt und 2 h (Peptidyl-Aminopeptidase) bzw. 10 h (Transglutaminase-aktivierende Metalloprotease) bei 28 °C inkubiert. Aminopeptidase-Aktivität wurde durch die Freisetzung von gelbem para- Nitroanilin, Endoproteasenaktivität nach Coomassie-Färbung (3.5.1) durch farblose Flecken im blauen Agarosegel nachgewiesen. Materialien und Methoden 53 3.12 Reinigung der Enzyme von Streptomyces mobaraensis Zur Gewinnung von Proteinen aus dem Kulturmedium wurde Streptomyces mobaraensis im Komplexmedium kultiviert. Außerdem wurden Proteine aus der Extraktion von mit Streptomyces bewachsenen GYM-Platten erhalten. Die zentrifugierten und filtrierten Kulturmedien bzw. Kulturextrakte wurden über AS- oder EtOH-Fällung konzentriert, ggf. entsalzt und umgepuffert. Die anschließende Chromato- graphie der Proteine erfolgte nur im Falle der Isolierung einer Arg-C-Protease aus dem Kulturmedium mit einer Pharmacia-Standardchromatographie-Anlage. Ansonsten wurde mit der beschriebenen Merck-Hitachi�FPLC-Anlage gearbeitet, wobei unterschiedliche Chromatographie-Materialien eingesetzt wurden. Puffer wurden in destilliertem Wasser angesetzt und vor der Chromatographie im Ultraschallbad entgast. Jede Säule wurde dabei mit dem 2-3fachen Säulenvolumen an Äquilibrierpuffer auf den notwendigen pH eingestellt. Die Elution der Proteine während des Chromatographie-Verlaufes wurde durch kontinuierliche Messung der Absorption bei 280 nm verfolgt. Chromatographien erfolgten bei Zimmer- temperatur, während die Fraktionen bei 4 °C gesammelt wurden. Nach Abschluss des Verfahrens wurden die Säulen zunächst mit 0,2 M NaOH, dann mit Puffer A und B gespült und mit 20 % (v/v) Ethanol oder 0,02 % (w/v) Natriumazid bei Zimmertemperatur gelagert. 3.12.1 Isolierung von ProTGase und TGase In Anlehnung an Pasternack et al. [1998] wurde ein modifiziertes ProTGase-Reinigungs- schema etabliert, welches die Gewinnung von ProTGase ohne TGase und P14 ermöglichte. Zur Isolierung der Proteine wurde S. mobaraensis für etwa 48 h bei 28 °C im Komplex- medium kultiviert. Das Kulturmedium wurde durch Zentrifugieren und Filtrieren von unlöslichen Stoffen und Zellen befreit und anschließend durch EtOH-Fällung eingeengt. Der aus der Lösungsmittel-Fällung erhaltene Niederschlag wurde in Puffer A aufgenommen, so dass eine 3-4fache Konzentrierung der Proteinlösung im Vergleich zum ursprünglichen Kulturmedium erreicht wurde. Chromatographiebedingungen und -verlauf sind in Tab. 3-9 und 3-10 wiedergegeben. Materialien und Methoden 54 Tab. 3-9: Gewählte IAC-Chromatographiebedingungen für die Teilreinigung von ProTGase und TGase aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Stationäre Phase Fractogel EMD SO3 - 650 (S) Durchmesser: 2,6 cm Betthöhe: 13 cm Bettvolumen: 69 cm3 Mobile Phasen 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 1 M NaCl in Puffer A (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 6,5 ml/min Fraktionen 6,5 ml Tab. 3-10: Zeitlicher Verlauf einer IAC-Chromatographie für die Teilreinigung von ProTGase und TGase aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 70-80 ml Durchlauf nichtbindender Proteine 100 - ca. 250 ml Plateau (0,1 M NaCl) 90 10 ca. 325 ml Linearer Gradient [0,33 % B/min] 90-50 10-50 ca. 750 ml Nach dem ersten Chromatographieschritt wurde bereits aktivierte TGase in den vereinigten ProTGase-fraktionen durch Hitzedenaturierung ausgefällt. Hierfür wurde die Mischung für 30 min bei 60 °C inkubiert und anschließend 15 min bei 4 °C gekühlt. Ausgefallene TGase wurde durch Zentrifugieren (10000 g, 15 min, 4 °C) abgetrennt. Noch vorhandenes P14 wurde durch eine nachfolgender Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE-Sepharose, Durchmesser 1,0 cm, Betthöhe 10,2 cm, Bettvolumen: 8,0 cm3) abgetrennt. Die Säule wurde mit 50 mM Tris-HCl pH 9,0 aquilibriert und mit dem Überstand des hitzedenaturierten Probe, die mit dem gleichen Puffer umgepuffert wurde, mit einer Flussrate von 1 ml/min beladen. P14 eluierte im Vorlauf, während ProTGase durch Erniedrigen des pH-Wertes mit 50 mM Tris-HCl pH 7,0 bei einem pH-Wert um 8,0 von der Säule gespült wurde. Die ProTGase enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei -20 °C gelagert. Materialien und Methoden 55 Reife TGase, die für Referenzmessungen benötigt wurde, eluierte bei der Ionenaustausch- Chromatographie an Fractogel SO3 - bei pH 5,0 in einem separaten Peak und konnte durch eine zweite IAC an Fractogel SO3 - nach der Methode von Gerber et al. [1994] bis zu Homogenität gereinigt werden. 3.12.2 Teilreinigung einer Arg-C Endoprotease S. mobaraensis wurde etwa 70 h in Komplexmedium kultiviert, das Kulturmedium wurde durch Zentrifugieren (10000 x g, 15 min, 4 °C) und Filtrieren über einen Faltenfilter von unlöslichen Bestandteilen und Mikroorganismen befreit. Gut lösliche Proteine wurden durch eine 40 %ige Ammoniumsulfat-Fällung abgetrennt. Der Überstand wurde erneut zentrifugiert und filtriert (0,45 µm) und ohne weitere Vorbehandlung für eine nachfolgende Hydrophobe Interaktions-Chromatographie verwendet. Chromatographiebedingungen und -verlauf sind in den Tab. 3-11 und 3-12 wiedergegeben. Tab. 3-11: Gewählte HIC-Chromatographie-Bedingungen für die Abtrennung einer Arg-C- Protease aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Stationäre Phase Phenyl Sepharose 6 FF (low sub) Durchmesser: 0,7 cm Betthöhe: 2,5 cm Bettvolumen: 1,0 cm3 Mobile Phasen 50 mM Tris-HCl pH 7,0 + 1,73 M Ammoniumsulfat 50 mM Tris-HCl pH 7,0 (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 1 ml/min Fraktionen 1 ml Materialien und Methoden 56 Tab. 3-12: Zeitlicher Verlauf der HIC-Chromatographie (Phenylsepharose) für eine Arg-C- Protease aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 4 ml Durchlauf nichtbindender Proteine 100 - 30-40 ml Stufengradient Stufe 1 (0,87 M) 50 50 10-15 ml Stufe 2 (0,43 M) 25 75 ca. 5 ml Stufe 3 (0,22 M) 12,5 87,5 ca. 5 ml Stufe 4 (0,00 M) - 100 ca. 5 ml Die Ammoniumsulfat-Konzentrationsstufen wurden so lange aufrechterhalten bis die Absorption annähernd die Basislinie bei 280 nm erreichte. Die Fraktionen wurden auf TGase- (Hydroxamat-Test) und Proteaseaktivität (Verwendung von CBZ-Pro-Phe-Arg-pNA und Ala- Pro-pNA) untersucht sowie durch SDS-PAGE charakterisiert. Arg-C Endoprotease- enthaltende Fraktionen wurden entsalzt, vereinigt und bei -20 °C eingefroren. 3.12.3 Reinigung von TAMEP Zur Gewinnung der Transglutaminase aktivierenden Metalloprotease wurde Streptomyces mobaraensis zwischen 24 h und 2 Monaten auf GYM-Agarplatten kultiviert. Ein Extrakt der löslichen Proteine wurde mit 15-20 ml 2 mM CaCl2 in Tris-HCl-Puffer pH 7,5 hergestellt, filtriert und durch Fällung mit Ammoniumsulfat bis 80 % (w/v) eingeengt. Der Niederschlag wurde in Puffer A gelöst, so dass eine 8 bis 14fache Konzentrierung resultierte, durch Filtration (0,45 µm) von Schwebstoffen befreit, über Gelpermeations-Chromatographie (HiPrep 26/10-Säulen) entsalzt, mit verdünnter Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt und anschließend durch Filtration (0,45 µM Filter) von unlöslichen Bestandteilen befreit. Die Proteine der so behandelten Lösung wurden anschließend, wie in den Tab. 3-13 und 3-14 dargestellt, durch Anionenaustauschchromatographie getrennt. Materialien und Methoden 57 Tab. 3-13: Gewählte IAC-Chromatographie-Bedingungen für die Abtrennung der TAMEP aus Extrakten der Festmedienkulturen von S. mobaraensis. Stationäre Phase DEAE-Sepharose Durchmesser: 1,0 cm Betthöhe: 10,2 cm Bettvolumen: 8,0 cm3 Mobile Phasen 50 mM Tris-HCl pH 8,5 + 2 mM CaCl2 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 2 mM CaCl2 1 M NaCl in Puffer B (Puffer A) (Puffer B) (Puffer C) Flussrate 1 ml/min Fraktionen 1 ml Tab. 3-14: Zeitlicher Verlauf der IAC-Chromatographie (DEAE-Sepharose) für die Teilreinigung der TAMEP. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Puffer C [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - - 10-25 ml Durchlauf nicht bindender Proteine, pH 8,5 100 - - 20-50 ml Durchlauf nicht bindender Proteine, pH 8,0 - 100 - 10-20 ml Stufengradient Stufe 1 (20 mM) - 98 2 10-20 ml Stufe 2 (40 mM) - 96 4 20-40 ml Stufe 3 (60 mM) - 94 6 20-30 ml Stufe 4 (150 oder 200 mM) - 85-80 15-20 30-40 ml Die Reinheit der TAMEP-enthaltenden Fraktionen wurde mit Exo- und Endoprotease- Substraten sowie über SDS-PAGE überprüft. Fraktionen mit vergleichbar hohen Aktivitäten gegenüber Furylacryloylderivaten bzw. Pro-Transglutaminase wurden vereinigt und bei -20 °C ohne Konzentrieren eingefroren. TAMEP-Präparate, die Spuren einer Arg-C-Endoprotease enthielten, wurden durch Arg- Sepharose-Chromatographie weiter gereinigt. Dazu wurde mit den Proben wie in den Tab. 3-15 und 3-16 gezeigt, weiter verfahren. Materialien und Methoden 58 Tab. 3-15: Gewählte Chromatographie-Bedingungen (Arg-Sepharose 4B) für die Abtrennung der TAMEP von einer Arg-C-Protease. Stationäre Phase Arg-Sepharose 4B Durchmesser: 1,0 cm Betthöhe: 7,6 cm Bettvolumen: 6,0 cm3 Mobile Phasen 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 2 mM CaCl2 1 M NaCl in Puffer A (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 1 ml/min Fraktionen 1 ml Tab. 3-16: Zeitlicher Verlauf der Chromatographie (Arg-Sepharose 4B) für die Reinigung der TAMEP. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 8-11 ml Peak I nicht bindender Proteine 100 - 10-20 ml Peak II nicht bindender Proteine 100 - 25-30 ml Stufengradient bis 100 % B 100-0 0-100 80-100 ml TAMEP bindet nicht an das Säulenmaterial und eluierte mit der Arg-C-Protease und weiteren Proteinen im Durchlauf. Die Fraktionen des zweiten Peaks enthielten TAMEP. Sie wurden vereinigt, lyophilisiert und anschließend gegen 2 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, dialysiert. Das 15fach konzentrierte Präparat wurde auf Arg-C-Endoprotease und Trans- glutaminase-aktivierende Protease kontrolliert und anschließend bei -20 °C gelagert. 3.12.3 Reinigung einer Peptidyl-Aminopeptidase Ausgangsmaterial zur chromatographischen Reinigung der Peptidyl-Aminopeptidase waren nach einer Kultivierung im Komplexmedium erhaltene, zellfreie, durch Ethanol-Fällung eingeengte 50-70 h alte Kulturmedien. Der 3-5fach konzentrierte, in Puffer A gelöste Niederschlag der Ethanol-Fällung wurde zum Abtrennen größerer Partikel zentrifugiert (10000 x g, 4 °C, 10 min) und sterilfiltriert (0,45 µm Filter). Die Peptidyl-Aminopeptidase wurde durch Kationenaustausch-Chromatographie teilgereinigt. Chromatographiebedingungen und -verlauf sind in den Tab. 3-17 und 3-18 zusammengefasst. Materialien und Methoden 59 Tab. 3-17: Gewählte IAC-Chromatographie-Bedingungen für die Abtrennung einer Peptidyl- Aminopeptidase aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Stationäre Phase Fractogel EMD SO3 - 650 (S) Durchmesser: 2,6 cm Betthöhe: 13 cm Bettvolumen: 69 cm3 Mobile Phasen 50 mM Tris-HCl pH 7,0 1 M NaCl in Puffer A (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 6,5 ml/min Fraktionen 6,5 ml Tab. 3-18: Zeitlicher Verlauf der IAC-Chromatographie für eine Peptdidyl-Aminopeptidase aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 40-80 ml Durchlauf nicht bindender Proteine 100 - ca. 300 ml Plateau 90 10 ca. 130 ml Linearer Gradient [1 % B/min] 90-10 10-90 ca. 650 ml Alle proteinenthaltenden Fraktionen wurden auf Aktivität und Proteingehalt überprüft und durch SDS-PAGE, Western-Blot und charakterisiert. Die Peptidyl-Aminopeptidase enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei -20 °C gelagert. In der Regel wurden die Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität in einer Mischung A, die übrigen in einer Mischung B vereinigt. Zur Abtrennung hochmolekularer Proteine wurde zusätzlich eine Phenylsepharose-Chromatographie durchgeführt. Materialien und Methoden 60 Hydrophobe-Interaktions-Chromatographie (HIC): Die Präparate A oder B wurden mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 1,73 M versetzt. Durch Filtration (0,45 µm) wurde die Lösung von ausgefallenen Proteinen und Schwebstoffen befreit und anschließend auf die Säule gegeben. Der Chromatographie-Verlauf und die verwendeten Parameter sind in den Tab. 3-19 und 3-20 aufgeführt. Tab. 3-19: Gewählte HIC-Chromatographie-Bedingungen für die Reinigung einer Peptidyl- Aminopeptidase. Stationäre Phase Phenyl-Sepharose High Performance Durchmesser: 1,0 cm Betthöhe: 9,5 cm Bettvolumen: 7,5 cm3 Mobile Phasen 1,73 M Ammoniumsulfat in 50 mM Tris-HCl pH 7,0 50 mM Tris-HCl pH 7,0 (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 1,0 ml/min Fraktion 1,0 ml Tab. 3-20: Zeitlicher Verlauf der HIC-Chromatographie (Phenylsepharose) für eine Peptdidyl- Aminopeptidase. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%} Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 15-35 ml Durchlauf nichtbindender Proteine 100 - ca. 45 ml Plateau 50 50 ca. 20 ml Linearer Gradient [1 % B / min] 50-0 50-100 20-50 ml Die Peptidyl-Aminopeptidase-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt. Konzentrierung und Umpufferung erfolgten durch Ultrafiltration, die Lagerung bei -20 °C. Materialien und Methoden 61 3.12.5 Reinigung einer Leu/Phe-Protease S. mobaraensis wurde im Komplexmedium zwischen 60 und 110 h bei 28 °C kultiviert. Das durch Zentrifugation und Filtration zellfreie, durch Ethanol-Fällung konzentrierte Kultur- medium war Ausgangsmaterial für den ersten von drei chromatographischen Reinigungs- schritten. Das 4-5fach eingeengte Kulturmedium, gelöst in Puffer A, wurde vor dem Aufgeben auf die IAC-Säule durch Zentrifugieren und Filtration von Schwebstoffen befreit. Der erste Chromatographie-Schritt zur Reinigung der Peptidase war eine Anionenaustausch-Chromato- graphie. Diese wurde entsprechend den nachstehenden Tab. 3-21 und 3-22 durchgeführt. Tab. 3-21: Gewählte IAC-Chromatographie-Bedingungen für die Abtrennung einer Leu/Phe- Protease aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Stationäre Phase DEAE-Sepharose Durchmesser: 2,6 cm Betthöhe: 10,2 cm Bettvolumen: 54 cm3 Mobile Phasen 10 mM Tris-HCl pH 9,0 1 M NaCl in Puffer A (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 2 ml/min Fraktionen 2 ml Tab. 3-22: Zeitlicher Verlauf der IAC-Chromatographie Leu/Phe-Protease aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 15-25 ml Durchlauf nicht bindender Proteine Fraktionen ca. 6-15 100 - ca. 20 ml Durchlauf nicht bindender Proteine Fraktionen ca. F16-F21 100 - ca. 12 ml Elution der bindenden Proteine - 100 ca. 60 ml Die Fraktionen wurden auf proteolytische Aktivitäten gegenüber H-Phe-pNA und H-Leu- pNA untersucht und durch SDS-PAGE weiter charakterisiert. Aktive Fraktionen wurden bei -20 °C gelagert oder sofort weiterverarbeitet. Materialien und Methoden 62 Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität gegenüber den chromophoren Amino- säuren wurden in einer Mischung A, der Rest in einer Mischung B vereinigt. Die weitere Reinigung der Aminopeptidase wurde mittels Kationenaustausch-Chromatographie durch- geführt (Tab. 3-23 und 3-24). Präparat A wurde hierzu ohne pH-Änderung auf die Säule gegeben. Tab. 3-23: Gewählte Chromatographie-Bedingungen (Fractogel EMD SO3 - 650 (S)) für die Reinigung der Leu/Phe-Protease aus Pool A. Stationäre Phase Fractogel EMD SO3 - 650 (S) Durchmesser: 2,6 cm Betthöhe: 13 cm Bettvolumen: 69 cm3 Mobile Phasen 50 mM Tris-HCl pH 7,0 1 M NaCl in Puffer A (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 3 ml/min Fraktionen 3 ml Tab. 3-24: Zeitlicher Verlauf der IAC-Chromatographie für die Reinigung der Leu/Phe-Protease aus Pool A. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 10-20 ml Durchlauf nicht bindender Proteine 100 - ca. 80 ml Stufengradient Stufe 1 (0,2 M) - Peak I 80 20 ca. 30 ml Stufe 1 (0,2 M) - Peak II 80 20 ca. 30 ml Stufe 2 (1,0 M) 0 100 ca. 45 ml Die Hauptfraktionen wurden zu Mischung AA und die Nebenfraktionen zu Mischung AB zusammengefasst und gegebenenfalls bei -20 °C gelagert. Zur Abtrennung von P14 wurde mit Präparat AA eine Benzamidin-Chromatographie mit den in den Tab. 3-25 und Tab. 3-26 angegebenen Bedingungen durchgeführt Materialien und Methoden 63 Tab. 3-25: Gewählte Chromatographie-Bedingungen (Fractogel EMD SO3 - 650 (S)) für die Reinigung der Leu/Phe-Protease aus Pool AA. Stationäre Phase Benzamidin FF (high sub) Durchmesser: 0,7 cm Betthöhe: 2,5 cm Bettvolumen: 1,0 cm3 Mobile Phasen 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 2 mM CaCl2 1 M NaCl in Puffer A (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 1 ml/min Fraktionen 1 ml Tab. 3-26: Zeitlicher Verlauf der IAC-Chromatographie für die Reinigung der Leu/Phe- Protease aus Pool AA. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 5-15 ml Durchlauf nicht bindender Proteine 100 - ca. 15-20 ml Plateau (1,0 M) 0 100 ca. 5 ml Die Peptidase-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, gegen 2 mM CaCl2 in 50 mM Tris- HCl pH 8,0 oder destilliertes Wasser dialysiert und bei -20 °C gelagert. 3.12.6 Reinigung von P14 S. mobaraensis wurde zur Reinigung des TAMEP-Inhibitors P14 für etwa 48 h bei 28 °C im Komplexmedium kultiviert. Durch Zentrifugation und Filtration wurde das Kulturmedium von unlöslichen Stoffen und Zellen befreit und anschließend durch EtOH-Fällung eingeengt. Der Niederschlag der Lösungsmittel-Fällung wurde in Puffer A aufgenommen, so dass eine 3-4fache Konzentrierung der Proteinlösung im Vergleich zum ursprünglichen Kulturmedium erreicht wurde. Chromatographiebedingungen und -verlauf sind in Tab. 3-27 und 3-28 wiedergegeben. Materialien und Methoden 64 Tab. 3-27: Gewählte IAC-Chromatographiebedingungen für die Teilreinigung von P14 aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Stationäre Phase Fractogel EMD SO3 - 650 (S) Durchmesser: 2,6 cm Betthöhe: 13 cm Bettvolumen: 69 cm3 Mobile Phasen 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 1 M NaCl in Puffer A (Puffer A) (Puffer B) Flussrate 6,5 ml/min Fraktionen 6,5 ml Tab. 3-28: Zeitlicher Verlauf der IAC-Chromatographie für die Teilreinigung von P14 aus dem Kulturmedium von S. mobaraensis. Funktion Puffer A [%] Puffer B [%] Volumen [ml] Auftrag der Proteinlösung - - 70-80 ml Durchlauf nicht bindender Proteine 100 - ca. 250 ml Plateau (0,1 M NaCl) 90 10 ca. 325 ml Linearer Gradient [0,33 % B/min] 90-50 10-50 ca. 750 ml Die Fraktionen der IAC-Chromatographie wurden durch SDS-PAGE charakterisiert, P14- enthaltende Fraktionen wurden vereinigt. Das P14-Präparat wies nach der IAC-Chromatographie oftmals noch Spuren anderer Proteine auf. Diese Verunreinigungen wurden durch eine zweite Kationenaustausch-Chromatographie (Fractogel EMD SO3 - 650 (S), Durchmesser 2,6 cm, Betthöhe 13 cm, Bettvolumen 69 cm2) entfernt. Dazu wurde die Probe über Ultrafiltration (siehe 3.7.3) mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 umgepuffert und mit einer Fließgeschwindigkeit von 6,5 ml/min auf die Säule gepumpt. Die Chromatographie erfolgte mit einem linear ansteigenden NaCl-Gradienten von 0-1 M, P14 eluierte bei einer Salz-Konzentration von 0,1 M. Fraktionen mit P14 wurden vereinigt und bei -20 °C eingefroren. Materialien und Methoden 65 3.13 Sequenzanalyse der gereinigten Proteine 3.13.1 Transfer von Proteinen auf eine PVDF-Membran Neben der Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie können zu sequenzierende Proteine oder Proteinfragmente, deren Länge mindestens 60 Aminosäuren beträgt, durch Borat- Gelelektrophorese getrennt werden. Sind die Proteinmengen größer als 10 pmol, kann die Trennung des zu sequenzierenden Proteins auch über Tris-Glycin-Gele erfolgen. Nach dem Transfer der Proteine auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran und anschließendem Anfärben mit Coomassie (3.5.1.2) werden die Proteine ausgeschnitten und direkt zum Sequenzieren eingesetzt. In dieser Arbeit wurde das durch Borat- oder Tris-Glycin-Gelelektrophorese separierte Protein mit einer Semi-Dry-Blot-Apparatur auf eine PVDF-Membran transferiert. Um die nachfolgende Sequenzierungsreaktion nicht zu beeinträchtigen, wurde hierzu ein Puffer- system ohne Glycin nach Khyse-Anderson [1984] verwendet: Anodenlösung 1: 0,3 M Tris-Base 20 % (v/v) Methanol, sequencing grade pH 10,4 Anodenlösung 2: 25 mM Tris-Base 20 % (v/v) Methanol, sequencing grade pH 10,4 Kathodenlösung: 25 mM Tris-Base 40 mM ε-Aminocapronsäure 0,1 % (w/v) SDS 20 % (v/v) Methanol, sequencing grade pH 9,4 Nach der Elektrophorese wurde das Trenngel vom Sammelgel separiert und in Anoden- lösung 2 äquilibriert. Der Aufbau des Blots erfolgte wie nachfolgend aufgeführt, wobei die PVDF-Membran zuvor 30 s in Methanol geschwenkt und anschließend ebenfalls in Anoden- lösung 2 äquilibriert wurde. Insgesamt sechs auf die Größe des Trenngels zugeschnittene Blotpapiere sowie die Membran wurden in den entsprechenden Lösungen getränkt. Materialien und Methoden 66 Der Aufbau des Blots erfolgte von unten nach oben, beginnend auf der Anode der Semi-Dry Transferapparatur (Abb. 3-5): Kathode der Semi-Dry Blotapparatur 2 in Kathodenlösung getränkte Blotpapiere In Anodenlösung 2 äquilibriertes Trenngel In Anodenlösung 2 äquilibrierte PVDF-Membran 2 in Anodenlösung 2 getränkte Blotpapiere 2 in Anodenlösung 1 getränkte Blotpapiere Anode der Semi-Dry Blotapparatur Abb. 3-5: Aufbau des Semi-Dry-Blots nach Khyse-Andersen [1984] für den Spannungs- induzierten Proteintransfer auf eine PVDF-Membran. Der Transfer von Proteinen oder Proteinfragmenten erfolgte bei einer konstanten Spannung von 20 V für die Dauer von bis zu 90 min. Im Anschluss daran wurden die Proteine mit Coomassie angefärbt (3.5.1.2). Nach dem Trocknen der Membran auf einem Blotpapier wurden distinkte Proteinbanden mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Lagerung der immobilisierten Proteine erfolgte bis zur Sequenzierung bei -20 °C. 3.13.2 Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenzen der gereinigten Proteine Die Sequenzierungen der auf PVDF-Membranen transferierten Proteine wurden von Esplora GmbH (Darmstadt) mittels automatisiertem Edman-Abbau durchgeführt. Beginnend mit der jeweilig N-terminalen Aminosäure wird die Peptidkette mit Phenylisothiocyanat sequentiell degradiert. Nachfolgend wird die freigesetzte Phenylthiohydantoin (PTH)-Aminosäure durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie anhand ihrer Retentionszeit identifiziert. Materialien und Methoden 67 3.14 Bestimmung von Proteaseschnittstellen durch Sequenzanalysen 3.14.1 ProTGase als Substrat für Trypsin, Chymotrypsin und TAMEP 500 µl Agarose-immobilisiertes Trypsin und Chymotrypsin wurden dreimal mit jeweils 500 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,0 gewaschen. 500 µl ProTGase (0,4 mg/ml) wurden mit 5 U Trypsin-, 20 U Chymotrypsin-Immobilisat oder 400 µl TAMEP (2,2 µg/ml) in 100 mM Tris-HCl Puffer pH 7,0, der 2 mM CaCl2 enthielt, 45 min bei 30 °C in einem Thermomixer (300 rpm) inkubiert. 200 µl der Mischung wurden jedem Reaktionsansatz entnommen, durch SDS-PAGE getrennt, auf eine PVDF-Membran transferiert, und jeweils die ersten drei Aminosäuren der Protease-aktivierten Transglutaminase wurden über Edman-Abbau bestimmt. 3.14.2 Trypsin-, Chymotrypsin- und TAMEP-aktivierte TGase als Substrat für die Peptidyl-Aminopeptidase und die Leu/Phe-Protease 150 µl von Chymotrypsin-, Trypsin- oder TAMEP-aktivierter TGase wurden mit 30 µl PAP (0,1 mg/ml) bei 30 °C für 45 min im Thermomixer (300 rpm) inkubiert. In einem weiteren Reaktionsansatz wurden 150 µl TAMEP-aktivierte TGase mit 30 µl Leu/Phe-Aminopeptidase (Umsatz von 4,6 nmol Leu-pNA/min*ml) entsprechend behandelt. Die Mischungen wurden durch SDS-PAGE getrennt und nach Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran jeweils die ersten drei Aminosäuren der isolierten TGase via Edman-Abbau analysiert. Materialien und Methoden 68 3.15 Inhibierungsversuche 3.15.1 Inhibitoren Für die Protease-Inhibitionsstudien wurden die Inhibitoren von Tab. 3-29 verwendet. Tabelle 3-29: Protease-Inhibitoren zur Charakterisierung von Peptidasen Inhibitor Stammlösung Empf. Konz. Inhibitorklasse Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 20 mM in EtOH oder DMSO 0,1-1 mM Irreversibler Inhibitor für Serinproteasen 4-(2-Aminoethyl) benzolsulfonylfluorid (AEBSF) 20 mM in VE-H2O 0,1-2 mM Irreversibler Inhibitor für Serinproteasen Benzamidin 10 mM in VE-H2O 1-5 mM Kompetetiver Serinproteaseinhibitor Aprotinin (Polypeptid aus der Rinderlunge) etwa 0,02 mM in VE-H2O 1-10 µM Inhibitor durch die Bildung starker Komplexe mit Serinproteasen. L-1-Chlor-3-(4-tosylamido)-7-amino-2- heptanon (TLCK) 2 mM in VE-H2O 10-1000 µM Irreversibler Trypsin- Inhibitor P14 (Polypeptid, eigene Isolierung aus S. mobaraensis siehe 3.12.6) etwa 0,1 mM in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 - Inhibitor der SSI-Familie, bekannt als Serin- und Metalloproteaseinhibitoren; Leupeptin (Acetyl-Leucyl-Leucyl-Arginal) 1 mM in VE-H2O 10-100 µM Reversibler, kompetetiver Inhibitor von Serin- und Cysteinproteasen Chymostatin (Peptidaldehyd-Mischung aus drei Komponenten) 5 mM in 50 % in (v/v) EtOH 10-100 µM Reversibler, kompetetiver Inhibitor von Serin- und Cysteinproteasen Trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido-(4- guanidino)-butan (E-64) 0,5 mM in VE-H2O 1-10 µM Irreversibler Inhibitor von Cysteinproteasen Iodacetamid 50 mM in VE-H2O 1-10 mM Irreversibler Inhibitor von Cysteinproteasen Ethylendiamintetraacetat (EDTA) 200 mM in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 1-10 mM Reversibler Inhibitor von Metalloproteasen (Ehtylenglycol-bis-(2-aminoethyl)- tetraacetat) (EGTA) 200 mM in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 1-10 mM Reversibler Inhibitor von Metalloproteasen o-Phenanthrolin 200 mM in DMSO 1-10 mM Reversibler Inhibitor von Metalloproteasen Phosphoramidon (N-alpha-L-rhamnopyranosyloxy- (hydroxyphosphonyl)-L-leucyl-L- tryphtophan) 30 mM in VE-H2O 1-100 µM Reversibler Inhibitor von Metalloproteasen Pepstatin A (Isovaleryl-Val-Val-Sta*-Ala-Sta*-OH) 1 mM in 5 % (v/v) DMSO 1-10 µM Inhibitor von Sauren Proteasen Bestatin ([(2S,2R)-3-Amino-2-hydroxy-4- phenylbutanoyl]-L-leucin) 0,5 mM in VE-H2O 1-150 µM Kompetetiver Aminopeptidasen-Inhibitor * Sta = 3-hydroxy-6-methylheptanoyl Materialien und Methoden 69 3.15.2 Inhibierung der Peptidyl-Aminopeptidase Wenn nicht anders beschrieben, wurden alle Inhibitoren in VE-Wasser oder in 50 mM Tris- HCl pH 7,0 gelöst. Vor jeder Kinetikmessung wurden die Inhibitoren zusammen mit der Peptidyl-Aminopeptidase für 20 min bei 28 °C in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorinkubiert, um eine ausreichende Wechselwirkung der Inhibitoren mit der Protease zu gewährleisten. Eine Konzentration von 10 % EtOH (v/v) im Reaktionsansatz führte zur Stabilisierung der Aminopeptidase. Die Inhibitorkonzentration im Reaktionsansatz wurde entsprechend der Tab. 3-29 im Ergebnisteil eingestellt. Je Versuch wurde Exoprotease mit einer Aktivität gegen Ala-Ala-Pro-pNA von 3 µmol/min eingesetzt. Das Gesamtvolumen im Reaktionsansatz betrug 200 µl. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl 0,4 mM Ala- Ala-Pro-pNA gestartet. Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte wie unter 3.11.3 beschrieben. 3.16.3 Inhibierung der Transglutaminase-aktivierenden Metalloprotease Methode a mit ProTGase als Substrat: 20 µl TAMEP (10-60 µg/ml) wurden mit 20 µl TAMEP-Inhibitor (0,14-40 µg/ml) oder anderen Inhibitoren (s.o.) für 15 min bei 28 °C vorinkubiert. Aus diesem Ansatz wurden 20 µl entnommen, mit 20 µl ProTGase (0,37 mg/ml) und 30 µl 2 mM CaCl2 in 100 mM Tris-HCl pH 7,0 gemischt und bei 28 °C für 30 min inkubiert. 20 µl des Ansatzes wurden für die SDS-PAGE entnommen. Die Bestimmung der TGase-Aktivität im Rückstand entsprach der unter 3.11.2 beschriebenen Methode. Methode b mit FAAFA als Substrat: 1-10 µl Enzymlösung (TAMEP, Dispase oder Thermolysin) wurden mit 10 µl Inhibitorlösung (s.o.) und 170-179 µl 50 mM Tris Puffer pH 7,2, der auch 50 mM MES, 2 mM CaCl2 und 0,01 % Triton X-100 enthielt, gemischt und für 15 min bei 37 °C vorinkubiert. Durch Zugabe von 10 µl FAAFA (10 mM in DMSO) wurde die Reaktion gestartet (Endvolumen von 200 µl). Die Messung der Absorptionsabnahme bei 340 nm erfolgte für 20 min bei 28 °C oder 37 °C mit dem Genios-MTP-Lesegerät.