Untersuchungen zum N2O-Metabolismus des Nitrat-ammonifizierenden Bakteriums Wolinella succinogenes

Distickstoffmonoxid (N2O) ist neben Kohlendioxid (CO2) und Methan (CH4) eines der wichtigsten Treibhausgase, dessen Konzentration in der Atmosphäre seit dem Beginn der Industrialisierung kontinuierlich ansteigt. Bereits heute wird N2O für 9% des anthropogenen Treibhauseffektes verantwortlich gemacht. Auf Grund von verbesserten Produktionstechniken und einem gestiegenen Umweltbewusstsein sind die abiotischen Emissionen von N2O in den letzten Jahren gesunken. Im Vergleich dazu steigen jedoch die biotischen Emissionen aus Böden, Seen und Ozeanen, in denen N2O hauptsächlich von Mikroorganismen produziert und freigesetzt wird. Der geschätzte Anteil an der Gesamtbilanz liegt heute bei 70% mit steigender Tendenz für die Zukunft, bedingt durch die steigende Düngung von Agraflächen. Im Prozess der Denitrifikation kann Nitrit über Intermediate unter anaeroben Bedingungen zu Stickstoff reduziert werden. Dabei wird sowohl N2O durch respiratorische Stickstoffmonoxid- Reduktasen produziert als auch durch die Distickstoffmonoxid-Reduktase (N2OR) zu Stickstoff wieder reduziert. Die N2OR ist das einzige bekannte Enzym, welches die Reduktion von Distickstoffmonoxid (N2O) zu Stickstoff (N2) katalysiert. Die Einzigartigkeit der N2O- Reduktase führte zu einem umfangreichen Wissen über den Prozess der Denitrifikation an sich sowie über den Verlauf und die Regulation der N2O-Atmung in Denitrifizierern wie Paracoccus denitrificans. Im Kontrast zu diesem Organismus steht Wolinella succinogenes, ein Modellorganismus für die Nitrat-Ammonifikation. Dieses Bakterium besitzt keine respiratorischen NO-produzierenden Nitritreduktasen oder NO-Reduktasen wie sie typischerweise in Denitrifizierern zu finden sind. Trotzdem kodiert W. succinogenes für eine N2O-Reduktase, welche C-terminal eine Monohäm Cytochrome c-Domäne besitzt (cNosZ). Die N2OR von Denitrifizierern hat keine solche Domäne, weshalb die Reduktase als typisch bezeichnet wird. Trotz dieses Unterschiedes konnte für das gereinigte Enzym aus W. succinogenes eine Enzymaktivität, die mit der von P. denitrificans vergleichbar ist, ermittelt werden. Der N2O-Metabolismus in wachsenden Nitrat-ammonifizierenden W. succinogenes Kulturen wurde bislang aber nicht untersucht.
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der N2O-Reduktionsrate in Nitrat-ammonifizierenden W. succinogenes Kulturen. W. succinogenes Wildstamm besitzt im N2OR kodierendem Gen (nosZ) ein Insertionselement, welches das nosZ-Gen unterbricht. In der entsprechenden Deletionsmutante W. succinogenes ΔnosZ wurde das ganze nosZ-Gen entfernt. Der Stamm W. succinogenes kompPnosnosZ hingegen verfügt über ein intaktes nosZ-Gen ohne Insertionselement. In Kulturen mit Zellen dieser drei Stämme wurden die Gase NO, N2O und N2 in der Gasphase bestimmt. Bezüglich des Wachstums, des Nitrat- und des Nitritumsatzes wurden keine phänotypischen Unterschiede detektiert, jedoch zeigte die Analyse der

Seite 2 Gasprofile eine Akkumulation von N2O in den Kulturen mit W. succinogenes Wildstamm und W. succinogenes ΔnosZ. Im Vergleich dazu akkumulierte jedoch in Kulturen mit W. succinogenes kompPnosnosZ kein N2O sondern eine korrespondierende Menge an N2. Inhibierungsexperimente mit Acetylen bestätigten die N2O-Reduktase als Quelle für den detektierten molekularen Stickstoff. Solange Nitrat über Nitrit zu Ammonium reduziert wird, sind Zellen von W. succinogenes kompPnosnosZ in der Lage sowohl intern produziertes als auch extern hinzugefügtes N2O zu reduzieren. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das Verhältnis von dem Elektronendonor (Formiat) zu dem Elektronenakzeptor (Nitrat) keinen Einfluss auf die N2O-Reduktionsrate von W. succinogenes kompPnosnosZ hat. Obwohl W. succinogenes über keine respiratorischen NO-produzierenden Nitritreduktasen verfügt, wurde in allen Kulturen NO detektiert. Experimente mit Medium ohne Zellen zeigten eine chemische Dekomposition von Nitrit mit dem Medium-Zusatz Brain-Heart Infusion auf. Als NO-detoxifizierende Proteine wurden ein cytoplasmatisches Flavodieisenprotein (Fdp) sowie die periplasmatische Cytochrom c Nitritreduktase (NrfA) vermutet. Ihre Beteiligung an der Abwehr von nitrosativem Stress konnte bereits in anderen Arbeiten nachgewiesen werden, jedoch erfolgte keine experimentelle Identifikation der Produkte. Die Analyse der Gasprofile zeigte erhöhte Konzentrationen an NO und N2O in den Kulturen der W. succinogenes Einfach- und Doppelmutanten von nrfHA und fdp im Vergleich zu W. succinogenes Wildstamm auf. Dies spricht für das Vorhandensein eines zusätzlichen NO-detoxifizierenden Proteins in W. succinogenes. Bioinformatische Analysen aller verfügbaren cNosZ Sequenzen führten insgesamt zur Identifikation von 20 weiteren bakteriellen nos-Genclustern, welche für eine atypische N2O- Reduktase wie in W. succinogenes kodieren. Dabei gehören nicht alle entsprechenden Arten der Klasse der Epsilonproteobacteria an. Ein Vergleich der dazugehörigen nos-Gencluster zeigte eine einheitliche Anzahl und Reihenfolge der Gene in den untersuchten Bakterienarten auf. Auf Grund der Präsenz von Protein-kodierenden Genen, welche in den nos-Genclustern von Denitrifizierern nicht vorhanden sind, wird eine Beteiligung dieser putativen Proteine am Elektronentransfer vom Menachinol-Pool zur terminalen N2OR vermutet. Zur Verifizierung der hypothetischen Funktion sollten die putativen Elektronenüberträgerproteine NosC1, NosC2 und NosB produziert werden. Das möglicherweise transmembrane Protein NosB ließ sich bislang heterolog in Escherichia coli produzieren und kann in folgenden Arbeiten zur Anwendung kommen. Insgesamt lässt sich sagen, dass das Nitrat-ammonifizierende Bakterium W. succinogenes in der Lage ist sowohl N2O zu produzieren als auch zu reduzieren.

Global warming is moving more and more into the public consciousness. Besides the commonly mentioned carbon dioxide and methane, nitrous oxide (N2O) is a powerful greenhouse gas in addition to its contribution to depletion of stratospheric ozone. The increasing concern about N2O emission has focused interest on underlying microbial energy-converting processes and organisms harbouring N2O reductase (NosZ), such as denitrifiers and ammonifiers of nitrate and nitrite. Here, the epsilonproteobacterial model organism Wolinella succinogenes is investigated with regard to its capacity to produce and consume N2O during growth by anaerobic nitrate ammonification. This organism synthesizes an unconventional cytochrome c nitrous oxide reductase (cNosZ), which is encoded by the first gene of an atypical nos gene cluster. However, W. succinogenes lacks a nitric oxide (NO)-producing nitrite reductase of the NirS- or NirK-type as well as an NO reductase of the Nor-type. Using a robotized incubation system, the wild-type strain and suitable mutants of W. succinogenes that either produced or lacked cNosZ were analysed as to their production of NO, N2O and N2 in both nitrate-sufficient and nitrate-limited growth medium using formate as electron donor. It was found that cells growing in nitrate-sufficient medium produced small amounts of N2O, which derived from nitrite and, most likely, from the presence of NO. Furthermore, cells employing cNosZ were able to reduce N2O to N2. This reaction, which was fully inhibited by acetylene, was also observed after adding N2O to the culture headspace. The results indicate that W. succinogenes cells are competent in N2O and N2 production despite being correctly grouped as respiratory nitrate ammonifiers.