Bi-specific Aptamers mediating Tumour Cell Lysis
Bi-specific Aptamers mediating Tumour Cell Lysis
The aim of the work presented herein is the development of bi-specific DNA aptamers simultaneously binding to tumour cell overexpressed receptor tyrosine kinase c-Met and Fcγ receptor IIIα (CD16α) on Natural Killer (NK) cells to mediate specific tumour cell lysis. Comparable antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) plays a pivotal role in antibody-based tumour therapies. Tumour-bound therapeutic antibodies recruit Natural Killer cells via their Fc receptors and induce specific lysis of tumour cells. In comparison to therapeutic monoclonal antibodies, potential advantages of aptamers are a facile selection, cost-effective and uniform synthesis as well as no to low immunogenicity. CD16α specific DNA aptamers were isolated by SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) that bound with both high specificity and affinity (6 – 195 nM) to recombinant and NK cell expressed CD16α. Selected c-Met specific DNA aptamers showed high affinity (91 pM and 11 nM) and specificity to recombinant and cellular presented target protein as well. Two aptamers of each selection were optimised and coupled applying linkers of varying compositions and lengths to yield 24 constructs. Bi-specific aptamers that retained suitable binding properties and displayed simultaneous binding were applied in functional ADCC assays. Five bi-specific aptamers mediated cellular cytotoxicity dependent on aptamer and effector cell concentration. Displacement of a bi-specific aptamer from CD16α by the competing antibody 3G8 reduced aptamer-dependent cytotoxicity and hence confirmed the proposed mode of action. A bi-specific aptamer mediated specific lysis of human gastric and lung tumour cells, GTL-16 and EBC-1, respectively. These results represent the first gain of an effector function by coupling of two distinct aptamers to generate an anti-tumour effective molecule. A facile exchange of the tumourspecific aptamer to target other surface tumour markers could broaden the concept of aptamer-dependent cellular cytotoxicity to therapies of further tumour species.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung bi-spezifischer DNA Aptamere, die den auf Tumorzellen überexprimierten Tyrosinkinase-Rezeptor c-Met sowie den auf Natürlichen Killerzellen exprimierten Fcγ-Rezeptor IIIα (CD16α) gleichzeitig binden und dadurch eine spezifische Lyse von diesen Tumorzellen vermitteln sollen. Vergleichbare Antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) stellt einen Wirkungsmechanismus Antiköper-basierter Tumortherapien dar. An Tumorzellen gebundene therapeutische Antikörper rekrutieren dabei Natürliche Killerzellen, die eine Lyse der Krebszellen auslösen. Vorteile von Aptameren im Vergleich zu therapeutischen monoklonalen Antikörpern können eine einfache Selektion, kostengünstige und uniforme Synthese sowie geringe oder keine Immunogenität sein. Es wurden CD16α spezifische DNA Aptamere mittels SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) isoliert, die spezifisch und mit hoher Affinität (6 – 195 nM) an rekombinantes und auf Natürlichen Killerzellen exprimiertes CD16α banden. Selektierte c-Met spezifische DNA Aptamere zeigten ebenfalls hohe Spezifität und Affinität (91 pM und 11 nM) zu rekombinantem und zellulär präsentiertem Zielprotein. Je zwei optimierte CD16α und c-Met spezifische Aptamere wurden mit Linkern unterschiedlicher Zusammensetzungen und Längen in 24 Varianten verknüpft. Die Erhaltung der ursprünglichen Bindungseigenschaften und eine gleichzeitige Bindung an beide Zielproteine konnte in biochemischen Assays belegt werden. Fünf bi-spezifische Aptamere vermittelten zelluläre Zytotoxizität, die abhängig von der Aptamerkonzentration und der Menge an Effektorzellen war. Verdrängung eines bi-spezifischen Aptamers durch den die CD16α-Bindung kompetierenden Antikörper 3G8 führte zum Rückgang der Aptamer-vermittelten Zelllyse und bestätigte damit den postulierten Wirkmechanismus. Ein bi-spezifisches Aptamer vermittelte Lyse von humanen GTL-16 Magen- und EBC-1 Lungen-Tumorzellen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen zum ersten Mal die Erzeugung einer zusätzlichen Effektorfunktion durch Verknüpfung zweier unterschiedlicher Aptamere. Durch Austausch des Tumor-spezifischen Aptamers könnte dieses Konzept einfach und schnell zur Therapie von unterschiedlichen Tumoren verwendet werden.
