Entwicklung neuartiger Aldolasevarianten für nicht hydroxylierte Donorsubstrate mittels gelenkter Evolution

Durch Aldolasen ist es möglich, größere Moleküle mit definiertem Stereozentrum durch C-C-Verknüpfung regio-, und chemoselektiv aufzubauen. Die Fructose-6-phosphat-Aldolase (FSA) zeichnet sich durch ihr sehr breites Akzeptorsubstratspektrum aus; ihr Donorsubstratspektrum ist jedoch auf wenige α-Hydroxyketone limitiert. Um diese Selektivität zu überwinden und FSA-Varianten zu finden, welche nicht hydroxylierte Ketone wie Aceton, oder Aldehyde wie Propionaldehyd und Butyraldehyd als Donorsubstrat akzeptieren, wurde in dieser Arbeit eine smarte FSA-Mutantenbibliothek erstellt (Mutationen an Position D6 und T26). Verschiedene Assay-Methoden zum Screening dieser Bibliothek wurden evaluiert. Die mittels dünnschichtchromatographischem Assay gefundenen 25 FSA-Varianten wurden mittels HPTLC auf ihre Geschwindigkeit und mittels GC auf ihre kompetitive Donorselektivität für Aceton gegenüber Propionaldehyd hin getestet. Es wurden Proteinmodelle zur Erklärung der gefundenen Resultate erstellt. Die Aminosäure an Position 6 entscheidet über die Akzeptanz von hydroxylierten Substraten (D6 ist selektiv für Hydroxyaceton) bzw. von nicht hydroxylierten Substraten (D6A, D6L, D6H und D6E akzeptiert Aceton). Die Aminosäure an Position 26 entscheidet über die Selektivität gegenüber Aceton/Propionaldehyd. FSA D6H ist selektiv für Aceton, FSA D6H/T26L selektiv für Propionaldehyd. Mit ausgewählten FSA-Varianten (FSA D6A/T26I und FSA D6A/T26L) wurden präparative Reaktionen durchgeführt, die Diastereomerenreinheit (>94 % de) und die absolute Stereokonfiguration der so erhaltenen Produkte wurde mittels 2D-NMR und GC-MS bestimmt.

Aldolases enable the regio- and chemoselective synthesis of larger molecules with a defined stereocenter by C-C ligation. Fructose-6-phosphate aldolase (FSA) is characterised by its broad acceptor substrate spectrum, it is, however, limited to a few α-hydroxyketones as donor substrates. Our goal was to tackle these specificity issues and to discover FSA variants that accept non-hydroxylated substrates such as acetone, propionaldehyde and butyraldehyde as donors. In order to do so, we have developed a smart FSA library with mutations at position D6 and T26, and evaluated different assay methods. The 25 FSA variants that were identified as hits through a thin layer chromatographic assay were further screened by HPTLC to determine their relative activity. Moreover, a GC assay was devised to probe the donor selectivity of these variants in competition experiments (acetone vs. propionaldehyde). Our results were rationalised using newly developed protein models, which highlighted the importance of the aspartate residue in position 6 for wild type FSA. Wild type FSA is selective for hydroxylated donors, while mutants such as D6A, D6L, D6H and D6E show preference for non-hydroxylated substrates. The residue at position 26 affects the selectivity for acetone over propionaldehyde. Finally, preparative scale reactions were performed using selected FSA variants (FSA D6A/T26I and FSA D6A/T26L), the diastereomeric excess (>94 % de) and the absolute stereoconfiguration of the products were determined by NMR and GC.