Characterization of the FK506 binding protein 51-Glucocorticoid Receptor-p23 complex in living cells

FKBP51 is a co-chaperone known for its inhibitory role in GR signaling. Besides FKBP51, there are multiple other co-chaperones known to interact with the GR, such as the small protein p23 which ensures the correct folding and activity of the GR. Understanding the complex formation and protein-protein interactions in these complexes are crucial for comprehending the regulation and activity of proteins. In this work I analyzed the interaction of FKBP51 and p23 as well as the interaction of the GR and p23.
I utilized photoinducible crosslinking which relies on the incorporation of an unnatural amino acid at the surface of a protein. This unnatural amino acid can form a covalent bond with another protein in the vicinity upon UV irradiation. The covalent bond formation can then be analyzed by e.g. Western Blotting and deliver information about interaction sites between two proteins. I used this method in this work to show that (i) FKBP51 and p23 interact in dependence of Hsp90; (ii) the FKBP51-p23-Hsp90 complex can exist independently of the GR; (iii) the interaction of FKBP51 and p23 can be partially abolished by addition of the GR; (iv) FKBP51, GR and p23 can participate in a Hsp90 associated complex; and (v) FKBP51 enhances the GR p23 interaction while FKBP52 does not. Taken together, I showed the existence of a FKBP51-GR-p23-complex for the first time in cellulo. In addition to the data about FKBP51-p23 interactions, I also provided novel insights into the GR p23 interaction: I showed that (i) the GR carries two distinct interaction sites with p23; (ii) each interaction hotspot binds to a different region of the C-terminal domain of p23; and (iii) the C-terminal tail of p23 is necessary to enhance the GR activity, even though it is not as relevant for the interaction of the probed GR residues with p23. Overall, the data about the FKBP51-p23 and FKBP51-GR-p23 interaction I gathered provide additional information about the structures of the mentioned complexes in cellulo. This will prove useful in the future for further understanding of the GR regulation and ultimately may result in novel ways to manipulate the GR. In addition to the FKBP51-GR interaction, I also investigated the role of FKBP51 in NF κB signaling. I investigated multiple cell lines, different readouts and stimuli and was not able to determine an effect of FKBP51 degradation or inhibition on the NF κB activity in the chosen context.

FKBP51 ist ein Ko-Chaperon, das für seine inhibitorische Rolle im Glukokortikoid Rezeptor Signalweg bekannt ist. Neben FKBP51 gibt es noch andere Ko-Chaperone, die mit dem Glukokortikoid Rezeptor interagieren und wichtig sind für die korrekte Faltung und Aktivität des GR, zum Beispiel das kleine Protein p23. Die Bildung von Komplexen und Protein-Protein Interaktionen in diesen Komplexen sind ein wichtiger Schritt zum Verstehen die Regulation und Aktivität des Proteins. Um dieses Ziel zu erreichen habe ich die Interaktion von FKBP51 mit p23 und vom GR mit p23 untersucht. Ich habe UV-Licht induzierte Querverbindungen genutzt, um Informationen über Protein Protein Interaktionen zwischen FKBP51 und dem GR zu erlangen. Diese Methode basiert auf der Inkorporation von einer unnatürlichen Aminosäure in die Oberfläche eines Proteins. Diese unnatürliche Aminosäure generiert eine kovalente Bindung mit einem anderen Protein in der Nähe durch Bestrahlung mit UV-Licht. Die Bildung dieser kovalenten Bindung kann zum Beispiel über Western Blots analysiert werden und Information über die Interaktionsoberfläche von zwei Proteinen liefern. Ich habe diese Methode genutzt, um zu zeigen, dass (i) FKBP51 und p23 in Abhängigkeit von Hsp90 interagieren; (ii) der FKBP51-p23-Hsp90 Komplex unabhängig vom GR existieren kann; (iii) die Interaktion von FKBP51 mit p23 teilweise durch den GR verhindert werden kann; (iv) FKBP51, p23 und der GR in einem Hsp90-assoziierten Komplex vorliegen können und (v) FKBP51 die GR-p23 Interaktion im Gegensatz zu FKBP52 verstärkt. Zusammengenommen implizieren die genannten Ergebnisse die Existenz eines FKBP51-GR-p23 Komplexes, der bisher noch nicht beobachtet wurde. Zusätzlich zu den Daten über die FKBP51-p23 Interaktionen habe ich neue Informationen über die GR-p23 Interaktion generiert. Ich konnte zeigen, dass (i) der GR an zwei unterschiedlichen Stellen mit p23 interagiert; (ii) jeder der beiden Interaktionshotspots mit einem anderen Bereich der C-terminalen Domäne von p23 interagiert und (iii) die C-terminale Domäne von p23 nötig ist für die Steigerung der GR Aktivität, obwohl sie nicht notwendig ist für die Interaktion von untersuchten Positionen mit p23. Die Daten, die ich zu der Interaktion von FKBP51 mit p23 und FKBP51, p23 und dem GR gesammelt habe, bietet zusätzliche Informationen über die Strukturen der genannten Komplexe in cellulo. Diese Informationen werden hoffentlich in der Zukunft nützlich sein, um die GR Regulation besser zu verstehen und neue Wege zu finden, ihn zu manipulieren. Zusätzlich zu der FKBP51-GR Interaktion habe ich die Rolle von FKBP51 im NF κB Signalweg untersucht. Ich habe verschiedenen Zelllinien, Produkte und Stimuli getestet und konnte weder einen Einfluss der FKBP51 Inhibition noch des Abbaus auf die NF κB Aktivität zeigen.