Proteasen und Substrate für einen kompetitiven Fibrinogenschnelltest

Ein akuter Fibrinogenmangel stellt bei schweren Blutungen infolge von chirurgischen Eingriffen oder Traumata eine erhebliche Gefahr für Patienten dar. Die frühzeitige und präzise Bestimmung der Fibrinogenkonzentration im Plasma ist daher entscheidend für eine gezielte Substitutionstherapie mit Fibrinogenkonzentraten. Derzeit verfügbare Testverfahren sind jedoch mit hohen Kosten verbunden und weisen insbesondere im diagnostisch relevanten Konzentrationsbereich eine unzureichende Genauigkeit auf. Vor diesem Hintergrund wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuartiger enzymatischer Zwei-Felder-Kompetitionsassay entwickelt, der eine schnelle und kostengünstige Alternative darstellen soll. Das grundlegende Prinzip des Assays basiert auf der kompetitiven Umsetzung eines fluorogenen Substrats in zwei Reaktionskompartimenten. Dabei wird das Enzymsubstrat auf einer Seite in einer Konzentration nahe der Michaelis-Konstante (KM) und auf der anderen Seite in Überschuss eingesetzt. Die Anwesenheit von Fibrinogen als kompetitiver Inhibitor in beiden Kompartimenten führt zu messbaren Unterschieden in der Umsatzgeschwindigkeit des Substrats, woraus ein Umsatzfaktor berechnet wird, der mit der Fibrinogenkonzentration korreliert. Zu Beginn der Arbeiten wurde Thrombin als Testenzym verwendet und mit dem Substrat Z-GPR-AMC getestet. Die photometrische Auswertung wurde durch die Trübung infolge der Fibringerinnung gestört. Zwar konnte die Trübung durch den Zusatz des aggregationshemmenden Tetrapeptids GPRP vermindert werden, dies führte jedoch gleichzeitig zu einer Veränderung der Enzymkinetik. Fluoreszenzspektrometrische Messungen zeigten zwar verbesserte Ergebnisse, doch war die Steigung der Umsatzfaktorkurve im relevanten Konzentrationsbereich von 0–2 mg/mL Fibrinogen zu gering, um eine präzise Bestimmung zu ermöglichen. Zur Verbesserung des Assays wurden daher alternative Enzym-Substrat-Systeme getestet. Basierend auf Literaturdaten wurden sogenannte Snake Venom Thrombin-like Enzymes (SVTLEs), insbesondere Ancrod und Batroxobin, in die Untersuchungen einbezogen. Diese Enzyme zeichnen sich durch eine hohe Affinität zu Fibrinogen aus. Während Ancrod keine zufriedenstellenden Ergebnisse lieferte, zeigte Batroxobin vielversprechende Eigenschaften, wenngleich die in der Literatur beschriebenen submikromolaren KM-Werte für Fibrinogen nicht erreicht wurden. Ein zentrales Ziel der Arbeit war daher die Etablierung eines rekombinanten Expressionssystems für Batroxobin in Pichia pastoris. Sowohl ein Wildtyp-Gen als auch eine codonoptimierte Variante wurden in das pPIC9-Vektorplasmid kloniert und erfolgreich in den Wirtsstamm GS115 transformiert. Trotz vollständiger Integration des Gens in das Genom konnte zunächst kein Protein im Expressionsüberstand nachgewiesen werden. Erst durch zusätzliche Aktivitätstests auf Fibrinogen-Agaroseplatten sowie mit einem neu entwickelten Mikrotiterplatten-Assay konnte die Aktivität des exprimierten Batroxobins nachgewiesen und quantifiziert werden. Die Reinigung erfolgte mittels Nickelionen-Affinitätschromatografie. Trotz relativ niedriger Ausbeuten im Vergleich zu Literaturangaben konnte die Aktivität des rekombinanten Enzyms bestätigt werden. Weitere Optimierungen im Produktionsprozess, etwa durch Änderung der Kulturbedingungen und der Vorreinigungsstrategien, führten zu einer verbesserten Proteinqualität. Ein weiterer zentraler Aspekt der Arbeit war die Entwicklung spezifischer FRET-Substrate für Batroxobin, da handelsübliche Substrate keine ausreichenden Umsatzraten zeigten. Die synthetisierten FRET-Substrate basierten auf der Thrombin-Spaltstelle des Fibrinogen Aα-Peptids und wurden mittels Festphasensynthese hergestellt. Erste Versuche ergaben, dass bei den für den Zweikompartimente-Test erforderlichen Konzentrationen ein erheblicher Teil der Fluoreszenz durch den sogenannten Inner-Filter-Effekt (IFE) absorbiert wurde. Durch Verwendung von Mikroküvetten und Reduktion der Substratkonzentration konnte der IFE deutlich reduziert werden. Die optimierten Substrate, insbesondere das verlängerte Peptid Aminobenzoyl-DFLAEGGGVRGPR-3-Nitro-Tyrosin, zeigten deutlich verbesserte Anfangsgeschwindigkeiten und niedrigere KM-Werte. Eine weitere Verlängerung der Sequenz mit Glycin- und Argininresten am N-Terminus führte zu einer zusätzlichen Steigerung der Substratumsetzung. Das längste Substrat, Abz-DFLAEGGGVRGPR-3-Nitro-Tyr, wies schließlich mit 339 µM die niedrigste KM und mit 60 nmol min-1 BU-1 die zweithöchste vmax auf. Die abschließenden Tests mit dem optimierten Assaysystem und den eigens entwickelten FRET-Substraten zeigten, dass sich mit Batroxobin ein deutlich breiterer dynamischer Bereich der Umsatzfaktoren erreichen lässt als mit Thrombin. Die berechneten Z-Faktoren lagen über dem statistisch geforderten Schwellenwert von 0,7, was die Eignung des Assays für präzise Messungen im diagnostisch relevanten Bereich bestätigt. Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit mehrere wesentliche Fortschritte erzielt werden. Batroxobin wurde als geeignetes Enzym für den Zwei-Felder-Kompetitionsassay identifiziert und erfolgreich rekombinant in Pichia pastoris exprimiert, auch wenn die Produktionsausbeute noch optimiert werden muss. Zudem wurden spezifische FRET-Substrate entwickelt und getestet, die eine zuverlässige Umsetzung durch Batroxobin ermöglichen. Mit diesen Komponenten konnte ein funktionsfähiges Assayverfahren zur Bestimmung der Fibrinogenkonzentration etabliert werden. Diese Ergebnisse schaffen eine belastbare Grundlage für die Weiterentwicklung zu einem praxistauglichen diagnostischen Schnelltests, der in Zukunft eine raschere und verlässlichere Therapieentscheidung bei Fibrinogenmangel unterstützen könnte.

Acute fibrinogen deficiency poses a significant risk to patients suffering from severe bleeding due to surgical interventions or trauma. Early and precise determination of plasma fibrinogen levels is therefore crucial for targeted substitution therapy using fibrinogen concentrates. However, current diagnostic methods are costly and often lack sufficient accuracy, particularly within the clinically relevant concentration range. In this study, a novel enzymatic dual-field competition assay was developed to provide a faster and more cost-effective alternative. The assay principle relies on the competitive conversion of a fluorogenic substrate in two separate reaction compartments. In one compartment, the substrate is applied at a concentration near the Michaelis constant (KM), and in the other, in excess. The presence of fibrinogen as a competitive inhibitor leads to measurable differences in substrate turnover rates, from which a turnover factor is derived that correlates with the fibrinogen concentration. Initial experiments using thrombin and Z-GPR-AMC as substrate were hampered by turbidity caused by fibrin clot formation. Although addition of the aggregation-inhibiting tetrapeptide GPRP reduced turbidity, it also altered enzyme kinetics. Fluorescence-based measurements showed some improvement, but the slope of the turnover factor curve was insufficient within the clinically relevant fibrinogen range (0–2 mg/mL) for reliable quantification. To improve assay performance, alternative enzyme-substrate systems were explored. Snake venom thrombin-like enzymes (SVTLEs), in particular Ancrod and Batroxobin, were investigated due to their high affinity for fibrinogen. Ancrod did not yield satisfactory results, whereas Batroxobin demonstrated promising properties, although the submicromolar KM values reported in the literature could not be replicated. A key objective of this work was to establish a recombinant expression system for Batroxobin in Pichia pastoris. Both a wild-type gene and a codon-optimized variant were cloned into the pPIC9 vector and successfully integrated into the host strain GS115. Although no protein was initially detectable in the supernatant, additional activity assays using fibrinogen agarose plates and a newly developed microplate assay confirmed the enzymatic activity of the recombinant Batroxobin. Purification by nickel ion affinity chromatography yielded active enzyme, albeit at lower levels than reported in the literature. Process optimizations improved protein quality and activity. Another focus of the study was the development of specific FRET substrates, as commercial substrates did not provide sufficient turnover rates. The synthesized substrates were based on the thrombin cleavage site of fibrinogen Aα chains and produced by solid-phase synthesis. Initial experiments revealed substantial inner filter effects (IFE) at the substrate concentrations required for the assay, which were mitigated through the use of microcuvettes and reduced substrate concentrations. The optimized substrates, particularly the elongated peptide aminobenzoyl-DFLAEGGGVRGPR-3-nitrotyrosine, exhibited markedly improved initial velocities and lower KM values. Further extension of the sequence with glycine and arginine residues at the N-terminus resulted in an additional increase in substrate conversion. The longest substrate, Abz-DFLAEGGGVRGPR-3-nitrotyrosine, ultimately showed the lowest KM (339 µM) and the second highest vmax (60 nmol min⁻¹ BU⁻¹). Final tests with the optimized assay system demonstrated that Batroxobin enables a broader dynamic range of turnover factors compared to thrombin. The calculated Z-factors exceeded the statistically required threshold of 0.7, confirming the assay’s suitability for precise measurements within the clinically relevant concentration range. Overall, this study achieved several key advances. Batroxobin was identified as a suitable enzyme for the dual-field competition assay and successfully expressed recombinantly in Pichia pastoris, although production yields still require optimization. Specific FRET substrates enabling reliable turnover by Batroxobin were developed and validated. Together, these components enabled the establishment of a functional assay for fibrinogen determination, providing a solid foundation for the future development of a practical diagnostic rapid test that could support faster and more reliable treatment decisions in fibrinogen deficiency.