The Role of Trimodulin in Modulating COVID-19- and sCAP-Associated Inflammation in Endothelial and Immune Cells

Respiratory diseases are among the leading causes of death from diseases worldwide. The latest data from the World Health Organization (WHO) indicate that respiratory diseases, particularly COVID-19 caused by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2 (SARS-CoV-2), as well as severe community-acquired pneumonia (sCAP), have already resulted in ten million deaths worldwide. These data suggest that currently available medications are not sufficient to effectively combat these diseases. A promising option for the treatment of severe respiratory diseases is the immunoglobulin preparation trimodulin. It consists primarily of Immunoglobulin G (IgG) and additionally contains Immunoglobulins M (IgM) and A (IgA). Trimodulin has already demonstrated a significant clinical impact on the treatment of respiratory diseases in patients with sCAP and COVID-19. The effectiveness of trimodulin is based on its bifunctional molecular mechanisms. On one hand, trimodulin combats pathogens by promoting opsonization, phagocytosis, and initiating the complement system, triggering an initial defense response. On the other hand, the IgM and IgA enriched immunoglobulin preparation modulates the immune system by suppressing complement-dependent toxicity (CDC), binding to cytokines, inducing Fc receptor signaling, and reducing lymphocyte proliferation. However, previous studies primarily focused on the mode of action of trimodulin regarding bacterial endotoxins and phagocytosis in immune cells related to sCAP and COVID-19. Endothelial inflammation and dysfunction are key features of both respiratory diseases, making vascular endothelial cells crucial as they lead to excessive immune cell transmigration and tissue damage. This doctoral thesis firstly investigated trimodulin's influence on vascular endothelial cells in a model of sCAP and COVID-19-associated endothelial inflammation, where human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) and SARS-CoV-2 envelope protein (env). Endothelial inflammation was assessed by measuring the protein expression of ICAM-1 and VCAM-1, along with RNA expression of ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin. Trimodulin significantly reduced LPS and SARS-CoV-2 env-induced inflammation in HUVECs by downregulating ICAM-1, VCAM-1 protein expression, as well as ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin RNA expression. Proteomic analysis revealed that trimodulin significantly impacts TGFβ-associated proteins by reducing the abundance of TGFβ-related propeptides. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) confirmed that trimodulin activated TGFβ. Furthermore, the use of an integrin αvβ6/αvβ1 inhibitor, bexotegrast, demonstrated, that the trimodulin mediated TGFβ release was partially integrin dependent, and the inhibitory effect of trimodulin on ICAM-1 and VCAM-1 expression was linked to the activation of TGFβ. These findings underscore the positive impact of trimodulin in the treatment of sCAP and COVID-19-induced inflammation and provide a mechanistic explanation for its effect on reducing patient mortality. In addition, this thesis provides new insights into trimodulin’s influence on COVID-19-associated inflammation in primary immune cells. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated with SARS-CoV-2 env and R848, a toll-like receptor 7/8 (TLR7/8) activator. The production of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-1β was then measured at both RNA and protein levels. Trimodulin significantly reduced IL-6 and IL-1β RNA expression, as well as IL-6 protein release, in response to stimulation. These results suggest that trimodulin has immunomodulatory effects that could be beneficial in managing sCAP and COVID-19. By reducing IL-6-mediated inflammation, a marker of poor prognosis, trimodulin may prevent inflammation progression and tissue damage. Moreover, to investigate the connection between endothelial activation and tissue damage caused by immune cell transmigration, a leukocyte adhesion assay using the U937 cell line was developed. In a model of sCAP-associated endothelial inflammation, trimodulin significantly reduced U937 adhesion to HUVECs. These findings suggest that trimodulin has substantial potential to inhibit immune cells adhesion and therefore transmigration into inflamed tissue and thereby reducing the risk of tissue damage. Altogether, this doctoral thesis offers valuable insights into the immunomodulatory effects of trimodulin, with a focus on endothelial cells as well as immune cells, and highlights its substantial therapeutic potential in preventing tissue damage. These findings confirm the potential of trimodulin as a crucial therapeutic approach in the fight against respiratory diseases and open up new possibilities to evaluate trimodulin in other diseases in which endothelial inflammation and immune cell transmigration play a role.

Respiratorische Erkrankungen zählen weltweit zu den häufigsten Ursachen für krankheitsbedingte Todesfälle. Die neuesten Daten der Weltgesundheitsorganisation (WHO) verdeutlichen, dass insbesondere COVID-19, verursacht durch das Schwere Akute Atemwegssyndrom-Coronavirus Typ 2 (SARS-CoV-2), sowie die schwere, ambulant erworbene Pneumonie (sCAP) bereits zu zehn Millionen Todesfällen geführt haben. Diese Daten lassen darauf schließen, dass die aktuell verfügbaren Medikamente nicht ausreichen, um diese Erkrankungen effektiv zu bekämpfen. Eine vielversprechende Option für die Behandlung schwerer Atemwegserkrankungen ist das Immunglobulinpräparat Trimodulin. Es besteht hauptsächlich aus Immunglobulin G (IgG) und enthält zusätzlich Immunglobuline M (IgM) und A (IgA). Trimodulin hat bereits gezeigt, dass es einen erheblichen klinischen Einfluss auf die Behandlung von Atemwegserkrankungen bei Patienten mit sCAP und COVID-19 hat. Die Wirksamkeit von Trimodulin beruht dabei auf seinen bifunktionalen molekularen Mechanismen. Zum einen trägt Trimodulin dazu bei Erreger zu bekämpfen, indem es die Opsonisierung und anschließende Phagozytose fördert, an Endotoxine bindet und das Komplementsystem aktiviert, was eine initiale Abwehrreaktion gegen Pathogene auslöst. Zum anderen moduliert das mit IgM und IgA angereicherte Immunglobulinpräparat das Immunsystem, indem es die allgemeine komplementabhängige Toxizität (CDC) unterdrückt, an Zytokine bindet, Fc-Rezeptor-Signalisierung induziert und die Lymphozytenproliferation verringert. Nichtdestotrotz haben frühere Studien den Wirkmechanismus von Trimodulin bei sCAP und COVID-19 hauptsächlich im Kontext von bakteriellen Endotoxinen und Phagozytose untersucht. Endotheliale Entzündungen und Dysfunktionen sind jedoch wesentliche Merkmale beider respiratorischer Erkrankungen, wodurch die vaskulären endothelialen Zellen von entscheidender Bedeutung sind, da diese maßgeblich zur übermäßigen Immunzellentransmigration und Gewebeschädigung beitragen. In dieser Doktorarbeit wurde erstmals der Einfluss von Trimodulin auf vaskuläre endotheliale Zellen in einem Modell der sCAP- und COVID-19-assoziierten Endothelentzündung untersucht. Dabei wurden humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) mit Lipopolysaccharid (LPS) und dem SARS-CoV-2-Hüllprotein (env) stimuliert. Die Endothelentzündung wurde durch die Protein Expression von ICAM-1 und VCAM-1 sowie die RNA-Expression von ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin bewertet. Trimodulin hat signifikant die LPS sowie SARS-CoV-2 env induzierte endotheliale Entzündung herunterreguliert, indem ICAM-1, VCAM-1 Protein Expression als auch ICAM-1, VCAM-1 und E-selectin herunterreguliert wurden. Die anschließende proteomische Analyse ergab, dass Trimodulin einen signifikanten Einfluss auf TGFβ-assoziierte Proteine hat, indem es die Menge von TGFβ-bezogenen Propeptiden verringert. Ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestätigte, dass Trimodulin TGFβ aktivierte. Der Einsatz des Integrin-αvβ6/αvβ1-Inhibitors Bexotegrast zeigte, dass die Trimodulin-vermittelte TGFβ-Freisetzung teilweise integrinabhängig war und dass die Hemmung von ICAM-1 und VCAM-1 durch Trimodulin von der TGFβ-Aktivierung abhängig war. Diese Erkenntnisse unterstreichen die positive Wirkung von Trimodulin bei der Behandlung von sCAP und COVID-19-bedingter Entzündung und liefern eine mechanistische Erklärung für seine Wirkung zur Verbesserung der Patientenmortalität. Darüber hinaus liefert diese Doktorarbeit neue Erkenntnisse über den Einfluss von Trimodulin in einem Modell der COVID-19-assoziierten Entzündung in primären Immunzellen. Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMCs) wurden mit SARS-CoV-2 env und R848, einem Aktivator der Toll-like Rezeptoren TLR7/8, stimuliert. Anschließend wurde die Ausschüttung und Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-1β gemessen. Trimodulin reduzierte signifikant die stimulationsbedingte RNA-Expression von IL-6 und IL-1β sowie die Freisetzung des IL-6-Proteins. Diese Ergebnisse verdeutlichen die immunmodulatorischen Eigenschaften von Trimodulin, die für die Behandlung von sCAP und COVID-19 hilfreich sein könnten. Durch die Reduzierung der IL-6-vermittelten Entzündung, die oft als Marker für eine schlechte Prognose gilt, könnte Trimodulin dazu beitragen, das Fortschreiten der Entzündung und Gewebeschäden zu verhindern. Um die Verbindung zwischen endothelialer Aktivierung und der durch Immunzellentransmigration verursachten Gewebeschädigung zu untersuchen, wurde ein Leukozyten-Adhäsionsassay mit U937 Zellen etabliert. Trimodulin verminderte, in einem Modell der sCAP-assoziierten Endothelentzündung, signifikant die U937 Adhäsion an HUVECs. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Trimodulin ein erhebliches Potenzial dazu hat, die Immunzellenadhäsion, und somit auch deren Transmigration in entzündetes Gewebe zu hemmen, wodurch das Risiko von Gewebsschädigungen verringert wird. Insgesamt liefert diese Doktorarbeit wertvolle Erkenntnisse über die immunmodulatorischen Eigenschaften von Trimodulin, insbesondere in Endothelzellen, aber auch in Immunzellen, und zeigt, dass ein großes therapeutisches Potenzial besteht, Gewebeschäden zu minimieren. Diese Ergebnisse bestätigen das Potenzial von Trimodulin als wichtigen therapeutischen Ansatz im Kampf gegen Atemwegserkrankungen und eröffnen neue Möglichkeiten, Trimodulin auch bei anderen Erkrankungen zu evaluieren, bei denen endotheliale Entzündungen und Immunzellentransmigration eine Rolle spielen.