Regulation of homologous recombination sub-pathways at two-ended double-strand breaks

DNA double strand breaks (DSBs) are a detrimental form of DNA damages that drives genome instability and cancer development. DSBs can spontaneously arise during replication or as a result of the exposure to exogenous agents such as ionizing radiation (IR). Accurate repair of DSBs is necessary to preserve the genome integrity for cell survival. Homologous recombination (HR) is an important mechanism of DSB repair that utilizes an intact homologous DNA sequence as a template to faithfully restore the genetic information. In the repair of two-ended DSBs, two sub-pathways of HR are involved: the double Holliday Junction (dHJ) and the synthesis-dependent strand annealing (SDSA) sub-pathways. Although SDSA is previously thought to be the predominant HR sub-pathway in somatic cells, it appears that a distinct dHJ sub-pathway that is solely processed by dHJ resolution is primarily used to repair IR-induced DSBs during G2 phase. The chromatin remodeler ATRX has been shown to promote the dHJ sub-pathway via the interaction with DNA polymerase processivity factor PCNA. SDSA only becomes the primary HR sub-pathway in cell lines naturally lacking functional ATRX like U2OS cells and is completely dependent on RECQ5 helicase, but the underlying mechanisms of how RECQ5 promotes SDSA during G2 phase is unclear. Although ATRX and RECQ5 have been shown to promote the dHJ and SDSA sub-pathway respectively, little is known about how somatic cells regulate the usage of distinct HR sub-pathways.

In this thesis, I show that RECQ5 ATPase/helicase activity and its PCNA-interacting motifs are required for SDSA in ATRX-null U2OS cells. Notably, the over-expression of ATRX with functional ATPase and PCNA-interacting motifs outcompetes the RECQ5-dependent SDSA in U2OS cells. In ATRX-positive HeLa cells, ATRX is dominant over RECQ5 for HR repair. I further reveal that the over-expression of RECQ5 lacking the ATPase/helicase activity, but not the PCNA interacting motifs, in HeLa cells results in an HR repair defect. These data suggest that the binding of RECQ5 ATPase mutant to PCNA blocks interaction between PCNA and ATRX during HR. Taken together, the results obtained in this thesis indicate that HR sub-pathway choice during G2 phase is defined by the interaction of ATRX and RECQ5 with PCNA.

Previously, one of the technical challenges in the study of HR sub-pathways was the lack of human cell lines that specifically use SDSA or the dHJ sub-pathway, respectively. Given that U2OS cells exclusively use SDSA during G2 phase, I use this opportunity to conduct a candidate-based siRNA screen to look for SDSA-promoting helicases in response to IR. I identify RECQ1 helicase as a crucial factor for SDSA in G2 cells, in addition to RECQ5. Importantly, RECQ1 ATPase/helicase activity and DNA strand annealing activity are essential for SDSA. RECQ1 appears to be involved in the downstream strand annealing steps during SDSA. Besides a direct role in HR, I uncover an unexplored function of RECQ1 in regulating the DSB repair pathway choice in G2 phase. It has been previously shown that the core HR factor BRCA2 acts in concert with RAD52 during G2 phase to restrict the usage of DNA polymerase θ (POLθ)-mediated end-joining until mitosis. Here, I provide evidence that, in G2-phase U2OS cells, RAD52 also prevents the premature usage of an alternative DSB repair pathway that is independent of POLθ. The presence of RECQ1 in G2 phase may counteract the role of RAD52 by specifically removing RAD52 and promoting the usage of RECQ1-mediated SDSA over the POLθ-independent repair in U2OS cells. The pilot experiment suggests that HELQ is essential for this POLθ-independent repair pathway which is normally inhibited by RECQ1 and RAD52 during G2 phase.

Dynamic processing of D-loops is believed to be critical for HR sub-pathway usage. Importantly, our group has recently identified that RAD54 and its paralog RAD54B, which are both implicated in promoting D-loop formation and stabilization, facilitate the dHJ and SDSA sub-pathways, respectively. Presumably, the alteration of D-loop stability could affect the HR sub-pathway choice. Recent in vitro studies showed that the regulation of D-loop disruption by the topoisomerase TOP3A could funnel HR towards distinct sub-pathway. I therefore test if the loss of TOP3A alters the HR sub-pathway usage in vivo. Interestingly, the depletion of TOP3A in U2OS cells rescues the RECQ1-/RECQ5-/RAD54B-dependent repair defect demonstrating that the loss of TOP3A in U2OS cells bypasses the canonical SDSA. Surprisingly, the repair is not channeled to dHJ but to an alternative HR pathway that requires RAD54. I also investigate whether the loss of TOP3A affects the HR sub-pathway choice in HeLa cells that pre-dominantly use dHJ sub-pathway. I confirm that the ATRX-deficient HeLa cells exhibited an HR repair defect and strongly reduced the usage of IR-induced dHJ sub-pathway. Surprisingly, the loss of TOP3A in ATRX-deficient HeLa cells rescues this repair defects and re-allows the usage of dHJ sub-pathway. The occurrence of ATRX-independent dHJ sub-pathway in the absence of TOP3A illustrates an antagonistic relationship between ATRX and TOP3A in controlling the dHJ sub-pathway.

Despite the processing of dHJ intermediates being well defined, it remains poorly understood how cells promote the formation of these recombination intermediates. I discover RAD18 as a new dHJ-specific factor in response to IR. I present evidence that RAD18 facilitates the dHJ sub-pathway and maintains chromosomal stability in HeLa cells. The loss of RAD18 does not affect the IR-induced HR repair in G2-phase U2OS cells that exclusively use SDSA. Whether RAD18 is involved in supporting dHJ formation or processing of dHJs remains to be defined.

Collectively, this study contributed to our understandings of how human cells regulate the HR sub-pathway usage for repairing two-ended DSBs, with implications of the importance of PCNA interaction and D-loop disruption in manipulating the HR sub-pathway choice. The discovery and characterization of additional HR sub-pathway factors will further provide insights into the mechanisms of distinct HR sub-pathways and the crosstalk between HR and other DSB repair pathways.

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) gelten als die gefährlichste Form von DNA-Schäden und können die Instabilität des Genoms und die Krebsentwicklung fördern. DSBs können spontan während der Replikation oder als Folge der Exposition gegenüber exogenen Einflüssen wie ionisierender Strahlung (IR) entstehen. Die korrekte Reparatur von DSBs ist für die Bewahrung der genomischen Integrität und das Überleben der Zellen essentiell. Die Homologe Rekombination (HR) ist ein wichtiger Mechanismus der DSB-Reparatur, bei dem eine intakte homologe DNA-Sequenz als Vorlage für die originalgetreue Wiederherstellung der beschädigten genetischen Information verwendet wird. An der Reparatur von zwei-endigen DSBs sind zwei Unterwege der HR beteiligt: der Weg über eine doppelte Holliday Junction (dHJ) sowie der Weg des synthesis-dependent strand annealing (SDSA). Obwohl bisher angenommen wurde, dass das SDSA der vorherrschende HR-Unterweg in somatischen Zellen ist, scheint ein bestimmter dHJ-Unterweg zu existieren, bei dem die dHJ ausschließlich über den Prozess der Ressolution aufgelöst wird und der in erster Linie zur Reparatur von IR-induzierten DSBs während der G2-Phase verwendet wird. Es hat sich gezeigt, dass der Chromatin-Remodeler ATRX den dHJ-Unterweg über die Interaktion mit dem DNA-Polymerase-Prozessivitätsfaktor PCNA fördert. Das SDSA wird nur in solchen Zelllinien zum dominierenden HR-Unterweg, die eine natürliche ATRX-Defizient aufweisen (wie z. B. U2OS-Zellen) und ist vollständig von der Helikase RECQ5 abhängig. Die zugrunde liegenden Mechanismen, wie RECQ5 das SDSA während der G2-Phase fördert, sind aber noch unklar. Und obwohl gezeigt wurde, dass ATRX bzw. RECQ5 den dHJ- bzw. den SDSA-Unterweg fördern, ist wenig darüber bekannt, wie somatische Zellen die Nutzung verschiedener HR-Unterwege regulieren.

In dieser Arbeit zeige ich, dass die ATPase/Helikase-Aktivität von RECQ5 und seine PCNA-interagierenden Motive für das SDSA in ATRX-defizienten U2OS-Zellen essentiell sind. Eine Überexpression von ATRX mit funktioneller ATPase-Aktivität und PCNA-interagierenden Motiven verdrängt das RECQ5-abhängige SDSA in U2OS-Zellen. In ATRX-positiven HeLa-Zellen ist ATRX bei der HR-Reparatur gegenüber RECQ5 dominant. Außerdem beschreibe ich, dass eine Überexpression von RECQ5, dem die ATPase/Helicase-Aktivität, nicht aber die PCNA-interagierenden Motive fehlen, in HeLa-Zellen zu einem HR-Reparaturdefekt führt. Diese Daten legen nahe, dass die Bindung der ATPase-Mutante von RECQ5 an PCNA die Interaktion zwischen PCNA und ATRX während der HR blockiert. Insgesamt deuten die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse darauf hin, dass die Wahl des HR-Unterwegs während der G2-Phase durch die Interaktion von ATRX und RECQ5 mit PCNA bestimmt wird.

Bisher bestand eine der technischen Herausforderungen bei der Untersuchung der HR-Unterwege darin, menschliche Zelllinien zu finden, die spezifisch den SDSA- bzw. den dHJ-Unterweg nutzen. Da U2OS-Zellen während der G2-Phase ausschließlich das SDSA verwenden, nutze ich diese Zelllinie für ein auf Kandidaten basierendes siRNA-Screening, um nach Helikasen zu suchen, die das SDSA nach IR unterstützen. Ich identifiziere die Helikase RECQ1 als einen weiteren entscheidenden Faktor für das SDSA in G2-Zellen, neben RECQ5. Wichtig ist dabei, dass die ATPase/Helikase-Aktivität sowie die strandannealing-Aktivität von RECQ1 für das SDSA essentiell sind. Hierbei scheint RECQ1 an den nachgelagerten strandannealing-Schritten während des SDSA beteiligt zu sein. Neben einer direkten Rolle in der HR beschreibe ich eine unerforschte Funktion von RECQ1 bei der Regulierung der Auswahl des DSB-Reparaturweges in der G2-Phase. Es wurde bereits gezeigt, dass der essentielle HR-Faktor BRCA2 in der G2-Phase mit RAD52 zusammenwirkt, um die Nutzung des Reparaturwegs der DNA-Polymerase θ (POLθ) vermittelten Endverknüpfung (POLθ-mediated endjoining) bis zur Mitose zu beschränken. Hier zeige ich, dass RAD52 in U2OS-Zellen in der G2-Phase auch die vorzeitige Nutzung eines alternativen DSB-Reparaturwegs verhindert, welcher unabhängig von POLθ ist. Das Vorhandensein von RECQ1 in der G2-Phase kann dabei der Rolle von RAD52 entgegenwirken, indem es RAD52 entfernt und die Verwendung von RECQ1-vermitteltem SDSA gegenüber der POLθ-unabhängigen Reparatur in U2OS-Zellen fördert. Ein Pilotexperiment deutet dabei darauf hin, dass HELQ für diesen POLθ-unabhängigen Reparaturweg, der normalerweise durch RECQ1 und RAD52 während der G2-Phase gehemmt wird, essentiell ist.

Es wird angenommen, dass die dynamische Prozessierung von D-Loops für die Wahl des HR-Unterwegs entscheidend ist. Unsere Arbeitsgruppe hat vor Kurzem festgestellt, dass RAD54 und sein Paralog RAD54B, die beide die Ausbildung und Stabilisierung von D-Loops zu fördern scheinen, spezifisch den dHJ-Weg (bei RAD54) oder das SDSA (bei RAD54B) fördern. Vermutlich könnte eine Veränderung der D-Loop-Stabilität die Wahl des HR-Unterwegs beeinflussen. Kürzlich durchgeführte In-vitro-Studien haben gezeigt, dass die Regulierung der D-Loop-Auflösung durch die Topoisomerase TOP3A dazu führen kann, dass die HR einem bestimmten Unterweg zugeführt wird. Daher habe ich getestet, ob der Verlust von TOP3A die Nutzung von HR-Unterwegen in vivo verändert. Interessant ist, dass eine Depletion von TOP3A in U2OS-Zellen den RECQ1-/RECQ5-/RAD54B-abhängigen Reparaturdefekt aufhebt, was zeigt, dass der Verlust von TOP3A in U2OS-Zellen das kanonische SDSA umgeht. Überraschenderweise erfolgt die Reparatur dann aber nicht über den dHJ-Weg sondern über einen alternativen HR-Weg, der RAD54 benötigt. Ich untersuche auch, ob der Verlust von TOP3A die Wahl des HR-Unterwegs in HeLa-Zellen beeinflusst, die überwiegend den dHJ-Unterweg nutzen. Ich bestätige, dass ATRX-defiziente HeLa-Zellen einen HR-Reparaturdefekt aufweisen und die Nutzung des IR-induzierten dHJ-Unterwegs stark reduziert ist. Überraschenderweise hebt eine Depletion von TOP3A in ATRX-defizienten HeLa-Zellen diesen Reparaturdefekt auf und ermöglicht wieder die Nutzung des dHJ-Unterwegs. Das Auftreten dieses ATRX-unabhängigen dHJ-Unterwegs in Abwesenheit von TOP3A veranschaulicht eine antagonistische Beziehung zwischen ATRX und TOP3A bei der Kontrolle des dHJ-Unterwegs.

Obwohl die Prozessierung von dHJ-Intermediaten gut beschrieben wurde, ist nach wie vor kaum bekannt, wie Zellen die Ausbildung dieser Rekombinationsintermediate fördern. Ich beschreibe RAD18 als einen neuen dHJ-spezifischen Faktor nach IR. Ich zeige, dass RAD18 den dHJ-Unterweg fördert und die Chromosomenstabilität in HeLa-Zellen aufrechterhält. Der Verlust von RAD18 hat dagegen keinen Einfluss auf die IR-induzierte HR-Reparatur in der G2-Phase von U2OS-Zellen, die ausschließlich das SDSA verwenden. Ob RAD18 die dHJ-Ausbildung fördert oder an der Prozessierung der dHJ beteiligt ist, muss noch geklärt werden.

Insgesamt trägt diese Studie zu unserem Verständnis der Art und Weise bei, wie menschliche Zellen die Nutzung der HR-Unterwege zur Reparatur von zwei-endigen DSBs regulieren, wobei die Bedeutung der PCNA-Interaktion und der D-Loop-Auflösung für die Wahl des HR-Unterwegs deutlich wird. Die Entdeckung und Charakterisierung zusätzlicher für die HR-Unterwege spezifischer Faktoren wird weitere Einblicke in die Mechanismen der HR-Unterwege und die Wechselwirkungen zwischen HR und anderen DSB-Reparaturwegen liefern.