Non-homologous end joining of resected double-strand breaks in human cells involves a DNA fill-in process

Each cell in the human body is exposed to endogenous and exogenous damaging agents, leading to tens of thousands of DNA lesions daily. If these lesions are not repaired or are repaired incorrectly, they lead to mutations and genomic aberrations that can threaten the cell or organism viability. DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most deleterious type of lesions since both strands of the DNA backbone are broken and disrupted, increasing the risk of genomic rearrangements. In order to cope with DNA damage and prevent genomic alterations, cells have developed a complex network of signaling pathways and repair mechanisms. DNA DSBs are generally repaired by two main pathways: non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). NHEJ is particularly important as it is the only available repair pathway in G0/G1 phases, where the majority of cells in the human body reside. In contrast, HR repairs DSBs only during the late S and G2 phases when the sister chromatid is available to serve as a template for error-free repair. Previous research revealed that NHEJ repairs IR-induced DSBs in G1 with biphasic kinetics, involving a fast, resection-independent component and a slow, resection-dependent component. The fast component is error-prone, as minimal processing and fast ligation of the broken ends can result in deletions of genetic material. The slow component involves DNA end resection and the function of several nucleases known for their involvement in HR repair. However, the mechanism underlying resection-dependent NHEJ has not yet been entirely uncovered. In this project, the human breast epithelial cell line MCF10A was used as a model system to study the mechanism of resection-dependent NHEJ. Inhibition of resection in G1-MCF10A resulted in repair deficiency, highlighting that certain DSBs must undergo resection before repair can occur. A growing number of studies revealed that transcription plays an important role during DNA DSB repair, impacting genome stability. The cell cycle-specific analyses presented in this thesis support previous findings, demonstrating that transcription is also required for the repair of G1-MCF10A cells. In particular, the inhibition of transcription occurring after damage induction led to a significant reduction of repair in G1-MCF10A and revealed that resected breaks are dependent on transcription processes. Furthermore, results in this thesis suggest that G1-phase MCF10A cells require resection-dependent NHEJ for the repair of DSBs that arise in highly transcriptionally active genomic locations. This is consistent with previous findings showing that DSBs arising in genes in G1-mESCs are repaired via resection dependent NHEJ. Since cells that must preserve genomic integrity throughout generations rely on resection-dependent NHEJ to repair DSBs in coding regions, it is believed this repair process has a high fidelity. Recent research has revealed that a fill-in mechanism similar to that occurring during the replication of telomeres could restore resected nucleotides at DSBs and convert ssDNA into dsDNA. Results in this work demonstrate that a fill-in mechanism dependent on the Pol α/primase complex synthesizes new DNA at resected breaks in G1 phase, allowing for the repair to be finalized. In this thesis, it was shown that a deficiency in resection, transcription, or fill-in synthesis results in the inability to complete the repair at certain DSBs in G1. This provides new insights into the repair processes during G1 phase, including a potential explanation of how cells maintain genomic integrity and stability.

Alle Zellen im menschlichen Körper sind endogenen und exogenen schädigenden Substanzen ausgesetzt, welche täglich zu Zehntausenden von DNA-Läsionen führen. Wenn diese Läsionen nicht oder nicht richtig repariert werden, führen diese zu Mutationen und genomischen Aberrationen, die die Überlebensfähigkeit der Zelle oder des Organismus gefährden können. DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen die gefährlichste Art von Läsionen dar, da beide Stränge des DNA-Rückgrats aufgebrochen und beschädigt werden, was das Risiko von genomischen Veränderungen erhöht. Um DNA-Schäden zu beheben und genomische Veränderungen zu verhindern, haben die Zellen ein komplexes Netzwerk von Signalwegen und Reparaturmechanismen entwickelt. DNA-DSBs werden im Allgemeinen durch zwei Hauptwege repariert: nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR). NHEJ ist besonders wichtig, da es der einzige verfügbare Reparaturweg in den G0/G1 Phasen ist, in denen sich die meisten Zellen im menschlichen Körper befinden. Im Gegensatz dazu repariert HR DSBs nur in der späten S- und G2-Phase, wenn das Schwesterchromatid als Vorlage für die fehlerfreie Reparatur zur Verfügung steht. Vorherige Untersuchungen haben gezeigt, dass NHEJ IR-induzierte DSBs in G1 mit einer biphasischen Kinetik repariert, die eine schnelle, resektionsunabhängige Komponente und eine langsame, resektionsabhängige Komponente umfasst. Die schnelle Komponente ist fehleranfällig, da die Prozessierung und schnelle Ligation der Bruchenden zu Deletionen von genetischem Material führen kann. Die langsame Komponente umfasst die Resektion von DNA-Enden und die Verwendung von mehreren Nukleasen, die für ihre Beteiligung an der HR-Reparatur bekannt sind. Der Mechanismus, der der resektionsabhängigen NHEJ zugrunde liegt, ist jedoch noch nicht vollständig erforscht. In diesem Projekt wurde die menschliche Brustepithelzelllinie MCF10A als Modellsystem verwendet, um den Mechanismus der resektionsabhängigen NHEJ zu untersuchen. Die Inhibition der Resektion in G1-MCF10A führte zu einem Reparaturdefizit, was deutlich macht, dass bestimmte DSBs resektiert werden müssen, bevor eine Reparatur stattfinden kann. Eine zunehmende Anzahl von Studien hat gezeigt, dass die Transkription eine wichtige Rolle bei der DNA-DSB-Reparatur spielt und die Stabilität des Genoms beeinflusst. Die in dieser Arbeit vorgestellten zellzyklusspezifischen Analysen unterstützen vorherige Erkenntnisse und zeigen, dass die Transkription auch für die Reparatur von G1-MCF10A-Zellen erforderlich ist. Insbesondere die Hemmung der Transkription nach der Schadensinduktion führte zu einer signifikanten Verringerung der Reparatur in G1-MCF10A-Zellen und zeigte, dass resektierte Brüche von Transkriptionsprozessen abhängig sind. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass MCF10A-Zellen in der G1-Phase zur Reparatur von DSBs, die in hochgradig transkriptionell aktiven genomischen Bereichen entstehen, eine resektionsabhängige NHEJ benötigen. Dies stimmt mit vorherigen Erkenntnissen überein, die zeigen, dass DSBs, die in Genen in G1-mESCs entstehen, durch eine resektionsabhängige NHEJ repariert werden. Da Zellen, die ihre genomische Integrität über Generationen hinweg bewahren müssen, bei der Reparatur von DSBs in kodierenden Regionen auf die resektionsabhängige NHEJ angewiesen sind, wird vermutet, dass dieser Reparaturprozess eine hohe Präzision aufweist. Jüngste Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass ein Fill in Mechanismus, ähnlich dem, der bei der Replikation von Telomeren auftritt, resektierte Nukleotide an DSBs wiederherstellen und ssDNA in dsDNA umwandeln könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein Fill-in-Mechanismus, der vom Pol α/Primase Komplex abhängt, neue DNA an resektierten Brüchen in der G1-Phase synthetisiert, so dass die Reparatur abgeschlossen werden kann. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass ein Defekt in der Resektion, Transkription oder Fill in Synthese dazu führt, dass die Reparatur an bestimmten DSBs in G1 nicht abgeschlossen werden kann. Dies gibt neue Einblicke in die Reparaturprozesse während der G1-Phase, einschließlich einer möglichen Erklärung dafür, wie Zellen die genomische Integrität und Stabilität aufrechterhalten.