Investigation of Protein Dynamics in Potassium Channels by Computational Means

Potassium channels are essential for multitudinous physiological processes in all domains of life as well as viruses. They maintain and modulate membrane potentials and are thereby involved in neuronal signal transmission. A detailed analysis of protein dynamics is necessary for a deeper understanding of mechanisms underlying ion conductance and selectivity in potassium channels as well as their regulation by external signals like changes in the membrane potential or ligand binding. Especially relevant is the stimulus-dependent opening and closing of the channel pore, the so-called "gating". In this work, three very different potassium channel families are investigated: Viral Kcv channels are characterized by their small size and their minimalistic structure, which resembles the channel pore if larger potassium channels. At the same time, their functional characteristics resemble those of canonical potassium cation (K$^+$) channels. Different synthetic channels were developed with Kcv as base pore domain. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel (HCN) are of central relevance in human physiology, both in neuronal and cardiac tissues. They are subject to dual gating by the prevalent membrane potential as well as to ligand binding. Transmembrane protein 175 (TMEM175) is a lysosomal channel, involved in pH regulation and potentially involved in the development of neurodegenerative diseases like alzheimers. These channels open and close in response to pH shifts in the lysosomal lumen. Together with and complementary to experimental data from cooperation partners, computer-aided methods were used in this work to analyze protein dynamics of these different channels: For the Kcv channel of Paramecium bursaria chlorella virus (Kcv PBCV- 1), only in silico modeled structures are available. In addition to these structures, newer neural network (NN)-based methods were employed to predict structures. Differences between previously available and newly predicted structuer models were analyzed structurally as well as with regards to their dynamics with elastic network models (ENMs) and molecular dynamics (MD). Here, NN-predicted channels deviate in a N-terminal subregion from older structural models and were less conductive in simulations. ENMs/linear response theory (LRT) were employed to study allostery between ligand binding sites in resolved cryogenic electron microscopy (cryo-EM) structures of HCN1 and HCN4. While results from previous studies on the allostery in HCN channels diverge, a previously identified allosteric pattern could be reproduced. Building on previous experimental and computational studies, the molecular mechanism of selectivity for the alkali metal cations Li$^+$, Rb$^+$ und Cs$^+$ in HCN4 was studied with MD simulations. This research was focused on structural factors allowing a discrimination between Na$^+$ and the smaller cation Li$^+$ as well as the binding site for Cs$^+$ -induced blockade. Potential subregions for these properties were identified in the selectivity filter. As a general pattern, geometric adaptations of selectivity filter residues, correlated with ionic radii of investigated cation species, was observed. Starting from the first resolved structure with the HCN blocker ivabradine bound to HCN4, MD simulations were used to study binding modalities and interactions. Here, the role of ivabradine's charge state on effective channel blockade was retraced. In the case of TMEM175, MD simulations were used to study the dynamics of a previously outlined potential pH-sensory site centered on histidine 57 (H57). In these simulations, stabilizing salt-bridge interactions of H57 were observed, which indicates a role of this residue in pH-sensing in TMEM175.

Kaliumkanäle sind essenziell für eine Vielzahl von physiologischen Prozessen in allen Domänen des Lebens sowie für Viren. Sie erhalten und modulieren Membranpotentiale und sind dadurch unter anderem maßgeblich an der neuronalen Reizweiterleitung beteiligt. Für ein genaues Verständnis der Mechanismen, die der Ionenleitfähigkeit und Selektivität von Kaliumkanälen sowie deren Regulation durch externe Signale, etwa einer Änderung des Membranpotentials oder der Bindung eines Liganden, zugrunde liegen, ist eine genauere Betrachtung der Proteindynamik erforderlich. Insbesondere das sogenannte "Gating", das Stimulus-abhängige Öffnen oder Schließen der Kanalpore, ist dabei von großer Relevanz. In dieser Arbeit werden drei sich stark unterscheidende Kalium-Kanal- Familien betrachtet: Die viralen Kcv-Kanäle zeichnen sich durch ihre geringe Größe sowie ihren simplen minimalistischen strukturellen Aufbau aus, welcher der zentralen Poren-Domäne in größeren K$^+$-Kanäle entspricht. Gleichzeitig weisen sie alle Eigenschaften dieser kanonischen K$^+$-Kanäle auf. Verschiedene synthetische Ionenkanäle wurden auf der Basis von Kcv entwickelt, unter anderem der spannungsabhängig-offene KvSynth1-Kanal. Hyperpolarisations-aktivierte, durch cyclische Nukleotide-gegatete (HCN) Kanäle sind für die humane Physiologie sowohl in neuronalen als auch in kardialen Geweben von zentraler Bedeutung. Sie unterliegen einem dualen "Gating", sowohl durch das vorherrschende Membranpotential als auch durch Ligandenbindung. Transmembranprotein 175 (TMEM175) ist ein lysosomaler Kanal, der an der pH-Regulation und damit möglicherweise an der Entstehung neuronaler Krankheiten wie Alzheimer beteiligt ist. Diese Kanäle öffnen und schließen abhängig von pH-Veränderungen im lysosomalen Lumen. Gemeinsam mit und komplementär zu experimentellen Ergebnissen von Kooperationspartnern wurden in dieser Arbeit computergestützte Methoden genutzt, um die Proteindynamik der verschiedenen Kanäle zu untersuchen: Für den aus Paramecium bursaria stammenden Kcv-Kanal (Kcv PBCV-1) sind bislang ausschließlich in silico modellierte Strukturen verfügbar. Mithilfe von neueren neuronalen Netzwerk (NN)-basierten Methoden wurden weitere Strukturen vorhergesagt. Unterschiede zwischen Strukturmodellen wurden strukturell sowie in Hinblick auf deren Dynamik mithilfe von elastischen Netzwerk Modellen (ENM) und Molekulardynamik-Simulationen (MD) untersucht. Die mithilfe von NN-basierten Methoden vorhergesagten Strukturmodelle weisen in einer am N-terminus lokalisierten Subregion eine abweichende Struktur auf und waren in Simulationen in geringerem Maße leitfähig. Bereits aufgelöste Cryo-EM Strukturen von HCN1 und HCN4 nutzend, wurden ENMs gemeinsam mit der linearen Antworttheorie genutzt, um die Allosterie zwischen Ligandenbindestellen zu untersuchen. In dieser Frage mit einander widersprechenden experimentellen Resultaten konnten Ergebnisse einer Studie mit einem bestimmten allosterischen Muster reproduziert werden. An vorherige experimentelle und computergestützte Studien anschließend wurde der molekulare Mechanismus für die Selektivität von HCN4 für die Alkali-Kationen Li$^+$, Rb$^+$ und Cs$^+$ mithilfe von MDSimulationen untersucht. Insbesondere strukturelle Faktoren, die eine Diskriminierung zwischen Na$^+$ und dem kleineren Kation Li$^+$ ermöglichen sowie die Bindestelle für die Cs$^+$-induzierte Blockade standen dabei im Fokus. Eine mögliche Subregion für die Diskriminierung zwischen Na$^+$ und Li$^+$ im Selektivitätsfilter sowie die Cs$^+$-Bindestelle konnten identifiziert werden. Als allgemeineres Muster konnten geometrische Anpassungen der Residuen des Selektivitätsfilters, die mit den Ionenradii der untersuchten Spezies korreliert waren, beobachtet werden. Ausgehend von der ersten aufgelösten Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Struktur mit dem HCN4-gebundenen HCN-Kanal-Blocker Ivabradin wurden MD-Simulationen durchgeführt, um bindungsrelevante Interaktionen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde die Relevanz des Ladungszustands von Ivabradin für eine effektive Kanalblockade mechanistisch nachvollzogen. Im Falle von TMEM175 wurden MD-Simulationen genutzt, um die Dynamik einer vorher identifizierten, möglichen pH-Sensorregion unter Beteiligung von Histidin 57 (H57) zu untersuchen. Stabilisierende Salzbrücken unter Beteiligung von H57 wurden in diesen Simulationen beobachtet, was auf eine Rolle dieser Residue in der pH-Sensierung von TMEM175 hindeutet.