Kinetische und präparative Studien mit neuen Sialinsäuresynthasen aus Neisseria meningitidis und Campylobacter jejuni

Für die Entwicklung neuer wirksamer Pharmazeutika gegen humanpathogene Mikroorganismen wie Neisseria meningitidis oder Campylobacter jejunii, bieten Sialokonjugate interessante neuartige Perspektiven. Um einen Zugang zu derartigen Sialokonjugaten für detaillierte Studien zu bekommen, bieten sich verschiedene Optionen an. Neben dem sehr aufwendigen und schwierigen Weg über die chemische Synthese rückt die enzymatische Synthese in den engeren Fokus. An der Biosynthese dieser Sialokonjugate, mit externen oder internen Sialinsäureresten, sind in den pathogenen Mikroorganismen Neisseria meningitidis oder Campylobacter jejunii eine Vielzahl von unterschiedlichen Enzymen beteiligt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten nun die in Campylobacter jejuni an der Biosynthese der Sialinsäure involvierten Sialinsäuresynthasen, spezifisch die N-Acetylneuraminsäuresynthase NeuSCje, die Pseudaminsäuresynthase PseSCje sowie das funktionell noch unbekannte NeuB2-Protein näher untersucht werden. Diese Enzyme waren bisher noch nicht tiefer gehend untersucht worden, diese bieten jedoch eine Alternative zur gängigen enzymatischen Synthese von Sialinsäuren mit der N-Acetylneuraminsäure Aldolase (NeuA). Im Gegensatz zur NeuA mit einer ungünstigen Gleichgewichtslage zugunsten der Edukte ist die von der NeuSCje und der PseSCje katalysierte Reaktion keine Gleichgewichtsreaktion. Um eine bessere Aussage über die Qualität der Substrate für die Synthese neuartiger, interessanter Sialinsäurederivate treffen zu können, sollten die Synthasen auch kinetisch untersucht werden. Im Zuge dieser kinetischen Untersuchungen sollte ein gekoppelter, kontinuierlicher High Throughput Assay entwickelt werden. Dieser Assay soll eine schnelle und effektive Untersuchung der Synthasen mit reproduzierbaren Ergebnissen möglich machen. Die für Kinetikstudien mit diesen Synthasen bisher verwendeten Assays waren alle diskontinuierlich und mit einer hohen Fehleranfälligkeit belegt. Auch sind die mit diesen Assays erreichbaren Nachweisgrenzen zu hoch, um damit in Kinetikstudien „initial rate“ Messungen in sehr geringen Konzentrationsbereichen duchzuführen. Durch die Entwicklung und Etablierung solcher kontinuierlicher, gekoppelter Enzym-Assays für die Sialinsäuresynthasen sollte auch die tolerierte Substratbreite der Enzyme untersucht werden. Bei den Synthasen NeuSNme und NeuSCje sollte ausgehend vom natürlichen Substrat N-Acetylmannosamin schrittweise die strukturelle und elektronische Grundstruktur verändert werden. Hierfür kamen Änderungen in der N-Acetylgruppe sowie strukturelle und konfigurative Änderungen im Zuckergrundgerüst in Frage. Für die Pseudaminsäuresynthase PseSCje war ein gleiches Vorgehen geplant. Zur Untermauerung der in den Kinetikstudien erhaltenen Ergebnisse sollten die Synthasen noch in präparativen/semi präparativen Synthesen mit den Substraten eingesetzt werden. Abschließend erschien es reizvoll, die Ergebnisse anhand von Strukturmodellen der Proteine vergleichend zu interpretieren.

Sialic acids as terminal units of cellsurface-located glycoproteins (e.g. gangliosides) play important roles in many biological events. Some pathogenic microrganisms,like Neisseria meningitidis or Campylobacter jejuni, use this structural motive as a molecular mimicry to prevent a reaction of the host´s immune system. In the metabolism of cellsurface-located sialylated lipooligosaccharides in these pathogenic microorganisms are involved several enzymes. So sialic acids and sialic acids synthases provide interesting and new perspectives to gain access to new sialoconjugates and also the possibility for the developement of new drug against these pathogenic microorganisms. Within the scope of this work three different sialic acid synthases from campylobacter jejuni should be investigated in a deeper form. Through preparative enzymatic synthesis with these sialic acid synthases should be investigated how wide is the subtrate tolerance of these enzymes. Kinetic studies, based on a new established high-throughput assay, with these sialic acids should confirm the result from the preparative studies. Finally for a further substantiation of these results the structure of these enzymes should be investigated and compared among each other.