Signaltransduktion, spezifische Hemmung und biotechnologische Anwendung des humanen TSLP-Rezeptors

Zytokine als sezernierte Botenstoffe sind ein wichtiger Teil der Kommunikation zwischen Zellen im Organismus. Durch Bindung von membranständigen Rezeptoren auf ihren Zielzellen induzieren sie Proliferation, Differenzierung und verschiedene zellphysiologische Vorgänge. Die Fehlregulierung dieser Prozesse durch verminderte oder erhöhte Expression der Zytokine und ihrer spezifischen Rezeptoren ist Ursache für viele Krankheitsbilder und bildet damit einen Hauptangriffspunkt bei der Behandlung und Therapie dieser Erkrankungen. Besonders die Beeinflussung der Wechselwirkung zwischen Zytokinen und ihren Rezeptoren durch Antikörper sowie Antagonisten und Agonisten bietet hierfür einen spezifischen Ansatz. Zur funktionellen Charakterisierung solcher biologisch aktiven Proteine, genannt ‚biologicals‘, ist es nötig ein spezifisches Readout-System zur Verfügung zu haben, welches die durch die Liganden-Rezeptor-Interaktion ausgelöste Aktivität in vitro nachbildet. Die Anforderungen an dieses System sind eine einfache und flexible Adaptierbarkeit an neue Zielmoleküle sowie die reproduzierbare Aktivitätsbestimmung der untersuchten Proteine mit geringem Kosten- und Zeitaufwand. Ein solches System wurde unter Verwendung von chimären Hybridrezeptoren auf der Basis der intrazellulären Bereiche des humanen Rezeptors für TSLP (Thymic Stromal Lymphopoeitin) aufgebaut. Durch deren Fusion mit extrazellulären Domänen von Rezeptoren aus der Familie der Zytokinrezeptoren, der Rezeptortyrosinkinasen und der Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren ließen sich beispielhaft funktionelle Hybridrezeptoren aufbauen, welche zur Bestimmung der Aktivität von Liganden und potentiell inhibitorischer Agenzien verwendet werden konnten. Die Bandbreite der bisher generierten Hybridrezeptoren weist auf das Potential dieses Systems hin, weitere Bioaktivitätsassays generieren zu können, um bei der Identifizierung von therapeutisch relevanten Proteinen zur Behandlung von dys-regulierten Liganden-Rezeptor-Interaktionen einen Beitrag zu leisten. Dem vorausgehend sind im Rahmen dieser Arbeit hinsichtlich der Signaltransduktion des Rezeptors für das Zytokin TSLP und der Aktivierung seiner Zielgene neue Erkenntnisse gewonnen worden. Diese untermauern die Komplexität der induzierten intrazellulären Prozesse und beteiligten Signalwege und bestärken damit die Annahmen, die TSLP als einen der Schlüsselfaktoren der asthmatisch-entzündlichen Erkrankungen definieren. Für die Interaktion zwischen TSLP und seinem Rezeptor wurden in dieser Arbeit zwei Herangehensweisen verfolgt. Durch Etablierung eines Reportergen-basierten Readouts konnte das inhibitorische Potential des Antikörpers 1E10, gerichtet gegen die TSLPRα-Rezeptorkette des TSLP-Rezeptors erstmals an einem TSLP-Zielgen (Ox40-Ligand) bestätigt werden. Durch eine gerichtete Mutation in der Aminosäuresequenz des Zytokins TSLP und dessen rekombinante Herstellung konnte eine mutierte Variante des TSLP generiert werden, welche eine deutlich verringerte biologische Aktivität aufwies. Ausgehend von diesen Erkenntnissen im Zusammenhang mit neuesten publizierten Daten zur Struktur des TSLP wird in dieser Arbeit ein Konzept vorgestellt, wie durch die Generierung von antagonistischen TSLP-Varianten ein therapeutischer Ansatz zur Beeinflussung TSLP-induzierter allergischer und asthmatischer Entzündungen gefunden werden kann.

Cytokines as secreted signaling molecules are a very important component of the communication between cells in the organism. By binding of membrane-bound receptors on their target cells they induce proliferation, differentiation and different physiological processes. Dys-regulation of these processes by up- or down-regulated expression of cytokines and their receptors is one major cause of many diseases and thereby attempt to be one major target of treatment and therapy of these diseases. One approach is the interference of cytokine receptor interactions by antibodies and antagonistic and agonistic molecules. To functionally characterize such proteins, also called ‘biologicals’, a specific read-out system is needed that can emulate ligand receptor interactions in vitro. The specification of this system is to be easily adaptable to new targets and to be highly reproducible in measuring the biological activity of target proteins combined with low costs and effort. Utilizing chimeric receptors based on the intracellular domains of the TSLP (Thymic Stromal Lymphopoeitin) receptor such a system was established. By fusion with extracellular domains of receptors from families of cytokine receptors, tyrosine-kinase receptors and serine/threonine-kinase receptors functional hybrid receptors were generated and used for measurement of activity of their ligands and potential inhibitory molecules. The spectrum of hybrid receptors produced underline the potential of the system to generate further bioactivity assays to contribute in the processes of finding novel therapeutically relevant molecules interfering with receptor ligand interactions. Preceding to this, novel insights in the signal transduction of the TSLP receptor and its activation of target genes were found. They confirm the complexity of induced intracellular processes and involved signaling pathways and thereby strengthen the belief of TSLP as a key player in asthmatic inflammatory diseases. For the interaction with TSLP and its receptor two approaches were followed. By establishing a reporter gene based read-out the inhibitory potential of the a-TSLPRa chain directed antibody 1E10 was confirmed by its ability to block activation of the TSLP target gene Ox40 ligand. By site-directed mutagenesis of the TSLP amino acid sequence a mutated variant was produced that features highly reduced activity. Based on this results combined with recently published findings on the structure of TSLP and its receptor a concept is introduced in this thesis how to generate antagonistic variants of TSLP as therapeutical approaches that can influence TSLP induced allergic and asthmatic inflammatory diseases.