Influence of ligand-gated chloride channels on neuronal differentiation in murine stem cell line

Neurogenesis describes the formation of new neurons, a process that continues throughout life and primarily occurs in the dentate gyrus of the hippocampus. This process is regulated by various intrinsic and extrinsic factors, including key neurotransmitter receptors such as NMDA, GABAA, and glycine receptors. These receptors contribute to distinct stages of neurogenesis by modulating proliferation, differentiation, and survival. While NMDA receptors are essential for synaptic integration and maturation, GABAA and glycine receptors, which are typically inhibitory in the adult brain, exert an excitatory effect during early neurogenesis, supporting neuronal survival and circuit formation. Together, these neurotransmitter receptors form a complex signaling network that guides the proper formation, functional maturation and integration of new neurons in the adult brain. Suppression or dysfunction of these receptors can lead to serious cognitive deficits and neurodevelopmental disorders like epilepsy, schizophrenia or hyperekplexia.

Functional maturation of newly generated neurons is characterized by the occurrence of spontaneous electrical activity which is an active driver of neuronal development and can be examined using various tools. One of them is the multi-electrode array (MEA) system. This non-invasive method allows for long-term, repeated measurements across entire cell cultures. Moreover, the MEA system is also capable of detecting even small changes in spontaneous activity when untreated cultures are compared with those under pharmacological treatment. For application to the adult stem cell line J1, which was already established in the working group, in a first step the MEA system was also established. Parameters like measurement threshold, measurement duration and cultivating conditions were determined and defined in order to obtain stable and reliable measurements. Next, the role of NMDA, GABAA, and glycine receptors on functional development was investigated by pharmacologically blocking them during differentiation. Blockade of NMDA receptor displayed no significant change in spontaneous activity, corresponding parameters and metabolic activity even though cell cultures contained a reduced number of neurons. Whereas for both the GABAA and glycine receptor, a simultaneous blockade exhibited significant reduced spontaneous as well as metabolic activity and also a reduced number of neurons. On this basis, in a next step the focus was to investigate whether the observed effects for GABAA and glycine receptor resulted from the blockade of one or both receptors. Hence, the two receptors were permanently blocked in separate approaches. Again, a significant reduced spontaneous activity with its corresponding parameters could be observed for both approaches. Interestingly, cell cultures treated with glycine antagonist Strychnine hydrochloride exhibited an increased metabolic activity when blocked in a single approach which was assumed to be caused by compensatory mechanisms attempting to counteract the blockade of the glycine receptor. Therefore, the reduced metabolic activity in the previous approach, in which both receptors were blocked simultaneously, was be attributed to the blockade of the GABAA receptor. In a last step, possible causes of reduced spontaneous activity where investigated at the cellular level first of all showcasing that membrane potentials of both approaches became more negative as neuronal differentiation progressed. Furthermore, morphological examination and immunofluorescent staining displayed a reduced number of neurons which featured shortened cell extensions and lack of network formation. Simultaneously, cultures displayed increased numbers of astrocytes which were arranged in bulk accumulations within the cultures. All these results were attributed to the absence of early excitatory input from GABAA and glycine receptors due to their (permanent) blockade which revealed an overall impairment of neuronal development.

In summary, the results presented in this work demonstrate that BOTH receptors for chloride transmission, the GABAA and glycine receptor, play crucial roles for proper neurogenesis. Early suppression of depolarization negatively affects neuronal development and contributes to neurodevelopmental disorders. Additionally, the MEA system proved to be a reliable method for long-term monitoring of spontaneous activity in differentiating J1 neural stem cells.

Neurogenese beschreibt die Bildung neuer Neurone, ein Prozess, der während des gesamten Lebens andauert und vor allem im Gyrus dentatus des Hippocampus stattfindet. Dieser Prozess wird durch verschiedene intrinsische und extrinsische Faktoren reguliert, darunter wichtige Neurotransmitter-Rezeptoren wie NMDA-, GABAA- und Glycin-Rezeptoren. Diese Rezeptoren tragen zu verschiedenen Stadien der Neurogenese bei, indem sie die Proliferation, Differenzierung und das Überleben der Zellen modulieren. Während NMDA-Rezeptoren für die synaptische Integration und Reifung unerlässlich sind, üben GABAA- und Glycin-Rezeptoren, die im erwachsenen Gehirn typischerweise inhibitorisch wirken, während der frühen Neurogenese eine exzitatorische Wirkung aus. So unterstützen sie das Überleben der Neurone und die Bildung von Schaltkreisen. Zusammen bilden diese Neurotransmitter-Rezeptoren ein komplexes Signalnetzwerk, das die ordnungsgemäße Bildung, funktionelle Reifung und Integration neuer Neuronen im erwachsenen Gehirn steuert. Eine Unterdrückung oder Funktionsstörung dieser Rezeptoren kann zu schweren kognitiven Defiziten und neurologischen Entwicklungsstörungen wie Epilepsie, Schizophrenie oder Hyperekplexie führen.

Die funktionelle Reifung neu gebildeter Neurone ist durch das Auftreten spontaner elektrischer Aktivität gekennzeichnet, die ein aktiver Treiber der neuronalen Entwicklung ist und mit verschiedenen Instrumenten untersucht werden kann. Eines davon ist das Multi-Elektroden-Array-System (MEA). Diese nicht-invasive Methode ermöglicht langfristige, wiederholte Messungen von ganzen Zellkulturen. Darüber hinaus ist das MEA-System auch in der Lage, selbst kleine Veränderungen der spontanen Aktivität zu erkennen, wenn unbehandelte Kulturen mit solchen unter pharmakologischer Behandlung verglichen werden. Für die Anwendung des Systems auf die bereits in der Arbeitsgruppe etablierte adulte Stammzelllinie J1 wurde auch dieses in einem ersten Schritt etabliert. Parameter wie Messschwelle, Messdauer und Kultivierungsbedingungen wurden bestimmt und definiert, um stabile und zuverlässige Messungen zu erhalten. Als nächstes wurde die Rolle von NMDA-, GABAA- und Glycin-Rezeptoren bei der funktionellen Entwicklung untersucht, indem sie während der Differenzierung pharmakologisch blockiert wurden. Die Blockade des NMDA-Rezeptors zeigte keine signifikante Veränderung der Spontan-Aktivität, der dazugehörigen Parameter und der metabolischen Aktivität, obwohl die Zellkulturen eine verringerte Anzahl von Neuronen aufwiesen. Bei den GABAA- und Glycin-Rezeptoren hingegen führte eine simultane Blockade zu einer signifikanten Verringerung der spontanen und metabolischen Aktivität sowie zu einem Rückgang der Neurone. Auf dieser Grundlage lag der Schwerpunkt im nächsten Schritt darauf, zu untersuchen, ob die beobachteten Effekte für GABAA- und Glycin-Rezeptoren auf die Blockade eines oder beider Rezeptoren zurückzuführen waren. Daher wurden beide Rezeptoren in separaten Ansätzen dauerhaft blockiert. Auch hier konnte bei beiden Ansätzen eine signifikante Verringerung der Spontan-Aktivität mit dazugehörigen Parametern beobachtet werden. Interessanterweise zeigten Zellkulturen, die mit dem Glycin-Antagonisten Strychninhydrochlorid behandelt wurden, eine erhöhte metabolische Aktivität, wenn sie alleine blockiert wurden, was vermutlich auf Kompensationsmechanismen zurückzuführen war, welche der Blockade des Glycin-Rezeptors entgegenwirkten. Daher wurde die verringerte metabolische Aktivität im vorherigen Ansatz, bei dem beide Rezeptoren simultan blockiert wurden, auf die Blockade des GABAA-Rezeptors zurückgeführt. In einem letzten Schritt wurden mögliche Ursachen für die verminderte Spontan-Aktivität auf zellulärer Ebene untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Membranpotenziale beider Ansätze mit fortschreitender neuronaler Differenzierung negativer wurden. Darüber hinaus zeigten morphologische Untersuchungen und Immunfluoreszenzfärbungen eine verringerte Anzahl von Neuronen, die verkürzte Zellfortsätze und eine fehlende Netzwerkbildung aufwiesen. Gleichzeitig wiesen die Kulturen eine erhöhte Anzahl von Astrozyten auf, die sich in großen Ansammlungen innerhalb der Kulturen anordneten. All diese Ergebnisse wurden auf das Fehlen früher exzitatorischer Inputs von GABAA- und Glycin-Rezeptoren aufgrund ihrer (permanenten) Blockade zurückgeführt, was eine allgemeine Beeinträchtigung der neuronalen Entwicklung offenbarte.

Zusammengefasst zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse, dass BEIDE Rezeptoren, welche für den Chlorid-Transport verantwortlich sind (GABAA- und Glycin-Rezeptor), eine entscheidende Rolle für die ordnungsgemäße Neurogenese spielen. Eine frühe Unterdrückung der Depolarisation wirkt sich negativ auf die neuronale Entwicklung aus und trägt zu neurologischen Entwicklungsstörungen bei. Darüber hinaus erwies sich das MEA-System als zuverlässige Methode für Langzeitmessungen der spontanen Aktivität in differenzierenden J1 neuronalen Stammzellen.