Conditional Control of Gene Expression in Mammalian Cells Using Synthetic Riboswitches

Synthetic riboswitches have recently attracted heightened interest in the fields of synthetic biology and functional genetics, as well as in relation to their potential therapeutic applications. The present study demonstrates that the control of alternative splicing by a riboswitch represents a promising approach to effectively regulate the expression of transgenes in mammalian cells. To this end, an artificial cassette exon with a premature termination codon was utilized, which enables the expression of the gene to be controlled by means of its skipping during the splicing process. The potential for enhancing the dynamic regulation of such systems was heretofore constrained solely by adjusting the riboswitch sequence without considering the gene’s context. Consequently, the well-known tetracycline riboswitch was selected to investigate the effects of the context and the insertion site of a cassette exon within the gene. In this system, the expression of an artificial arachidonate 5-lipoxygenase gene was controlled, and it was demonstrated that riboswitch-controlled cassette exons are readily transferable to another gene by means of contextual sequence adaptation. This was accomplished by introducing gene-specific intronic and exonic sequences, and conducting experiments on different intron lengths and positions. Conversely, the integration of non-adapted constructs resulted in a functionality that was unpredictable. Moreover, it was demonstrated that the utilization of two cassette exons within a single gene resulted in a substantial enhancement in switching capability. However, it was observed that the spatial proximity of the cassette exons appeared to influence the switching functionality. Consequently, the most effective cassette exon system was employed through genome integration into the monocytic leukemia cell line Mono Mac 6. This integration enabled the tetracycline-dependent re-expression of the 5-lipoxygenase. The newly established cell line was characterized in terms of its dose dependence and switching kinetics, and tested to confirm the non-canonical effects of the 5-lipoxygenase on cyclooxygenase 2 and kynureninase expression. This confirmed the previously described non-canonical effects of the 5-lipoxygenase and demonstrated the outstanding advantages of a riboswitch-controlled system in terms of time dependence. Finally, a novel riboswitch-dependent splicing concept was developed in this work, which allowed switching 5-lipoxygenase wild-type expression to the expression of the ∆13 isoform. Furthermore, the tetracycline-dependent splicing system was equipped with a novel doxycycline and tobramycin riboswitch and placed in the context of the checkpoint kinase 2 gene to test for functional differences and cross-dependencies. This work thus demonstrates the outstanding potential of riboswitch-dependent splicing control, which represents an innovative approach for future therapeutic applications.

Synthetische Riboschalter stoßen auf zunehmendes Interesse in der synthetischen Biologie, funktionellen Genetik und in möglichen therapeutischen Anwendungen. Diese Arbeit zeigt, dass die Kontrolle des alternativen Spleißens durch einen Riboschalter ein vielversprechender Ansatz ist, um die Expression von Transgenen in Säugetierzellen wirksam zu regulieren. Dafür wurde ein künstliches Kassetten-Exon mit vorzeitigem Terminations-Codon eingesetzt, welches die Expression des zu kontrollierenden Gens nur dann zulässt, wenn es beim Prozess des Spleißens übersprungen wird. Bislang war das Potenzial zur Verbesserung der dynamischen Regulierung von solchen Systemen ausschließlich durch die Anpassung der Riboschalter-Sequenz begrenzt, ohne den Kontext des Gens zu berücksichtigen. In dieser Arbeit wurde daher der bekannte Tetracyclin-Riboschalter ausgewählt, um die Auswirkungen des Kontexts und der Insertionsstelle eines Kassetten-Exons innerhalb des Gens zu untersuchen. Hierbei wurde die Expression eines künstlichen Arachidonat-5-Lipoxygenase-Gens kontrolliert und gezeigt, dass Riboschalter-gesteuerte Kassetten-Exons durch kontextuellen Sequenzanpassung leicht auf ein anderes Gen übertragbar sind. Dies wurde durch die Einführung von Gen-spezifischen intronischen und exonischen Sequenzen erreicht, wobei verschiedene Intron-Längen und -Positionen getestet wurden. Im Gegensatz dazu führte die Einführung nicht angepasster Konstrukte zu einer eher unberechenbaren Funktionalität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Kombination von zwei Kassetten-Exons in ein Gen zu einer deutlichen Verbesserung der Schaltfähigkeit führte. Hierbei stellte sich jedoch heraus, dass die räumliche Nähe der Kassetten-Exons einen Einfluss auf die Schaltfunktionalität zu haben scheint. Das am besten funktionierende Kassetten-Exon-System wurde folglich in Anwendung gebracht, indem es in die monozytäre Leukämie-Zelllinie Mono Mac 6 genomintegriert wurde. Dies ermöglichte so die Tetrazyklin-abhängige Re-Expression der 5 Lipoxygenase. Die neu etablierte Zelllinie wurde hinsichtlich ihrer Dosisabhängigkeit und Schaltkinetik charakterisiert und zur Bestätigung der nicht-kanonischen Effekte der 5 Lipoxygenase auf die Cyclooxygenase 2 und Kynureninase Expression überprüft. Dabei konnten die zuvor beschriebenen Effekte der 5 Lipoxygenase bestätigt und die herausragenden Vorteile eines Riboschalter-gesteuerten Systems in Bezug auf die Zeitabhängigkeit gezeigt werden. Schließlich wurde in dieser Arbeit ein neuartiges Riboschalter-gesteuertes Spleiß-Konzept entwickelt, das es ermöglichte, die 5-Lipoxygenase Wildtyp Expression auf die Expression der Isoform ∆13 zu wechseln. Zusätzlich wurde das Tetracyclin-gesteuerte Spleiß-System mit einem neuartigen Doxycyclin- und Tobramycin- Riboschalter bestückt und in den Kontext des Checkpoint-Kinase-2-Gens gebracht, um auf Funktionalitätsunterscheide und Kreuzabhängigkeiten zu prüfen. Diese Arbeit zeigt somit das umfangreiche Potenzial einer Riboschalter-gesteuerten Spleiß-Kontrolle auf, was mitunter einen innovativen Ansatz für zukünftige therapeutische Anwendungen darstellt.