Arming NK cells against leukemia and lymphoma with CARs and bispecific killer cell engagers

Acute myeloid leukemia (AML) is a highly aggressive hematologic malignancy with poor long term prognosis, particularly in older patients or those with relapsed or refractory disease. Despite advances in chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), the high relapse rate and limited treatment options underscore the urgent need for innovative treatment strategies, especially immunotherapeutic approaches that minimize adverse effects. In B cell malignancies, adoptive cellular therapy using autologous T cells engineered to express chimeric antigen receptors (CARs) has led to durable complete responses, prompting the development of CAR-based strategies also for AML. However, the expression of typical AML targets by subsets of healthy hematopoietic cells including hematopoietic stem cells (HSCs) poses a substantial risk of on target/off tumor toxicity, complicating clinical translation. Furthermore, the immunosuppressive bone marrow microenvironment and treatment resistance of leukemic stem cells (LSCs) present additional challenges that limit the efficacy of current cellular therapies. Natural killer (NK) cells are emerging as attractive candidates for CAR-based immunotherapy of AML, particularly when targeting antigens that are not strictly cancer specific. Unlike T cells, NK cells have the intrinsic ability to kill malignant cells without prior sensitization and pose a lower risk of graft versus host disease, allowing for the possibility of allogeneic off the shelf therapies. Nevertheless, most clinical studies with CAR NK cells to date have employed CAR constructs originally optimized for T cell biology, which do not exploit the full signaling potential of NK cells. Preclinical evidence suggests that the configuration of CAR structural domains, including transmembrane and intracellular signaling components, has a profound impact on NK cell activation and function. Furthermore, the optimal CAR architecture may vary depending on the specific target antigen and the cell binding domain used, necessitating empirical optimization. This thesis aimed to improve NK cell-based immunotherapy of AML and related hematological malignancies through two complementary strategies: the NK-specific optimization of CAR constructs, and the development of bispecific killer cell engagers (NKAB molecules) to redirect and potentiate NK cell cytotoxicity. Additional approaches included providing cytokine support via co-expression of an IL 15 superagonist, and combinatorial treatment strategies to overcome immune resistance. Thereby, the first part of this study focused on the design and optimization of NKG2D CAR constructs incorporating NK tailored functional domains. NKG2D is a key activating NK cell receptor that recognizes stress-induced ligands often upregulated on cancer cells, including AML blasts. In this work, six different NKG2D-CAR variants with distinct transmembrane (TM) and intracellular signaling domains were evaluated upon lentiviral transfer in the clinically relevant human NK 92 NK cell line. Among these CARs, a second-generation construct, incorporating the extracellular domain of NKG2D for target recognition, the TM domain of NKG2D, an intracellular 2B4 costimulatory domain and a CD3 signaling domain (NKAR.2, N.N.2B4.z) demonstrated the strongest cytotoxic activity despite lower surface expression, highlighting that optimal intracellular signaling outweighs receptor abundance. These findings were validated in the YTS NK cell line, confirming the superior functionality of NKAR.2. Nevertheless, previous clinical applications of NKG2D CARs have shown limited efficacy, which might be partly attributed to the frequent downregulation or shedding of NKG2D ligands (NKG2DLs) in AML, which impairs NK cell recognition. Therefore, the subsequent part of this study investigated pharmacological interventions to restore or enhance ligand expression. While the PARP inhibitor AG 14361 modestly increased NKG2DL levels without significantly improving NK cell-mediated lysis, the HDAC inhibitor Panobinostat significantly upregulated NKG2DLs in several AML cell lines. In particular, Molm 13 cells showed enhanced sensitivity to NK-mediated killing upon Panobinostat treatment, although this effect was not entirely NKG2D-dependent. AML lines such as OCI AML3 remained refractory to this approach, highlighting the heterogeneity of AML and the need for alternative, NKG2DL-independent targeting strategies. To bypass NKG2DL dependency, the AML-associated surface marker C type lectin like molecule 1 (CLL 1) was explored as an alternative therapeutic target. CLL 1 is consistently expressed on AML blasts and LSCs but absent on healthy HSCs, making it a promising candidate for selective targeting. To assess CLL 1-directed immunotherapy, six distinct CAR constructs were generated by combining three different CAR backbones with single-chain fragment variable (scFv) antibody domains either derived from the CLL 1-specific antibody M26 or MCLA 117. When expressed in NK 92 cells, all constructs mediated potent cytotoxic activity against CLL 1-positive AML cell lines. Although MCLA-based constructs showed reduced antigen binding compared to their M26-based counterparts, they achieved comparable cytolytic efficacy. Among all variants, CLL 1-CARs incorporating the N.2B4.z backbone consistently demonstrated superior effector function as previously observed for NKG2D CARs. Based on this enhanced performance and given that MCLA 117 is already used as a therapeutic antibody in the clinic, NK 92/MCLA.N.2B4.z cells were selected for further functional studies, including assays with primary patient-derived AML samples and in vivo testing. Thereby, despite exhibiting relatively low CAR surface expression, these CAR-engineered NK 92 cells demonstrated strong cytolytic activity against CLL 1-positive AML cells, which was also retained in a two-dimensional organotypic bone marrow niche model. However, in an in vivo OCI AML2 xenograft mouse model, MCLA 117-based CAR NK cells did not significantly delay tumor progression or improve survival, suggesting that additional strategies are required to overcome the immunosuppressive tumor microenvironment. To address this limitation, the IL 15 superagonist RD IL15 was co-expressed with CAR constructs to improve NK cell persistence and reduce dependence on exogenous cytokines. This modification allowed CAR NK cells to proliferate, survive, and retain cytotoxic function in the absence of external IL 2 supplementation, indicating robust autocrine and paracrine support for long term functional activity. In parallel experiments, this thesis explored the development of bispecific NKG2D-activating antibodies (NKAB molecules) designed to engage both, tumor-associated antigens and NKG2D-expressing immune effector cells. Thereby the bispecific killer cell engager NKAB CLL 1, incorporating a CLL 1-targeting domain (MCLA 117 scFv) and a high-affinity NKG2D-binding domain (Kyk 2.0 scFv), demonstrated effective binding to both, CLL 1+ cancer cells and NKG2D+ lymphocytes (NK, NKT, and CD8+ T cells). Accordingly, NKAB CLL 1 significantly enhanced the cytotoxicity of PBMCs and primary NK cells against CLL 1+ targets, without inducing fratricide in cytokine-expanded NK cells that had upregulated CLL 1 expression. AML cells can induce downregulation of NKG2D expression on NK cells via direct cell cell contacts and soluble factors, constituting a key immune evasion mechanism. This could be overcome by combining NKG2D CAR NK 92 cells and NKAB CLL 1. Combinatorial treatment with NKAR.2-expressing NK 92 cells and bispecific antibody NKAB CLL 1 led to significantly enhanced killing of CLL 1+ cancer cell lines and primary AML blasts that were otherwise resistant to NKAR.2 NK 92 cells alone. In a systemic xenograft mouse model, this combination therapy significantly delayed leukemia progression and prolonged survival, with most animals remaining symptom-free throughout the observation period. In contrast, NKAR.2 NK 92 cells without NKAB CLL 1 redirection showed no therapeutic benefit compared to parental NK 92 cells, underscoring the necessity of bispecific engagement for effective tumor targeting. To address tumor heterogeneity and reduce the risk of immune escape due to treatment-induced antigen loss, a modular dual-targeting strategy was implemented by combining NKAR.2 NK 92 cells with NKAB CLL 1 and a CD19-targeting NKAB CD19 molecule. This enabled selective killing of heterogeneous cancer cell populations expressing CLL 1 and/or CD19. Thereby, activation of effector cells was strictly target cell-dependent, minimizing the risk of undesired on target/off tumor effects. This approach was successfully extended to B cell malignancies, where the combination of CD19- and CD20-targeting NKAB molecules with NKAR.2-engineered NK 92 cells exhibited potent cytotoxicity against B cell acute lymphoid leukemia and lymphoma cell lines. In a Raji lymphoma xenograft mouse model, the combination of either NKAB engager molecule with NKAR.2 NK 92 cells achieved robust tumor suppression and significantly improved survival, further validating the therapeutic potential of this modular system. In conclusion, this thesis demonstrates the successful engineering of potent and specific NK cell-based immunotherapies through optimized CAR constructs, cytokine support, and redirection by bispecific killer cell engagers. The integration of these strategies allowed to circumvent key immune evasion mechanisms, such as antigen loss and effector cell suppression, and led to potent anti-tumor activity in preclinical models of AML and B cell malignancies. Hence, these findings provide a strong foundation for further development as experimental treatment approaches for AML and other hematological malignancies.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist die häufigste Form der Leukämie bei Erwachsenen und weist trotz etablierter Chemotherapie-Protokolle und der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) eine hohe Rezidivrate auf. Dies verdeutlicht den Bedarf an innovativen Behandlungsansätzen, insbesondere immuntherapeutischen Strategien mit möglichst geringer Toxizität. Bei Patientinnen und Patienten mit B Zell-Leukämien und Lymphomen konnte durch adoptive Immuntherapie mit autologen T Zellen, die nach Genmodifizierung spezifische chimäre Antigenrezeptoren (engl. chimeric antigen receptors, CARs) auf ihrer Oberfläche tragen, eine anhaltende Remission erzielt werden. Diese Erfolge haben zur Entwicklung CAR-basierter Strategien auch für die Behandlung der AML geführt. Deren klinische Anwendung wird jedoch dadurch erschwert, dass typische Zielantigene der AML auch auf gesunden hämatopoetischen Zellen wie insbesondere hämatopoetischen Stammzellen (engl., hematopoietic stem cells, HSCs) exprimiert werden, was ein erhebliches Risiko für zielgerichtete aber nicht tumorspezifische (on target/off tumor) Nebenwirkungen birgt. Darüber hinaus stellen das immunsuppressive Mikromilieu des Knochenmarks sowie die Therapieresistenz leukämischer Stammzellen (engl., leukemic stem cells, LSCs) zusätzliche Herausforderungen dar, welche die Wirksamkeit zellulärer Immuntherapien erheblich limitieren. Natürliche Killerzellen (NK Zellen) rücken zunehmend als vielversprechende Effektorzellen für CAR-Immuntherapien bei der AML in den Fokus, insbesondere wenn Zielstrukturen, wie im Fall der AML, nicht strikt tumorspezifisch sind. Im Gegensatz zu T Zellen können NK Zellen maligne Zellen ohne vorherige Sensibilisierung eliminieren und weisen zudem ein weit geringeres Risiko zur Auslösung einer Graft-versus-Host-Erkrankung auf. Dadurch eröffnen sich Perspektiven für allogene Off the Shelf-Therapien, insbesondere bei Verwendung der klinisch einsetzbaren humanen NK Zelllinie NK 92. Die bislang in klinischen Studien mit CAR NK Zellen genutzten CAR-Konstrukte wurden jedoch überwiegend für T Zellen optimiert und schöpfen daher nicht das volle Signalpotenzial von NK Zellen aus. Präklinische Daten legen nahe, dass die Konfiguration struktureller CAR-Domänen, insbesondere der Transmembrandomäne und der intrazellulären Signalsequenzen, einen maßgeblichen Einfluss auf Aktivierung und Funktion von NK Zellen hat. Zudem kann die optimale CAR-Architektur je nach Zielantigen und Zellbindungsdomäne variieren, und macht somit eine empirische Optimierung erforderlich. Das übergreifende Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung NK-Zell-basierter Immuntherapien für die AML und verwandte hämatologische Erkrankungen durch die Entwicklung zweier komplementärer Strategien: zum einen die Optimierung von CAR-Konstrukten durch Anpassung an die Signalübertragung in NK Zellen, und zum anderen die Entwicklung NKG2D-aktivierender bispezifischer Antikörper (engl., NKG2D-activating antibodies, NKABs), die NK Zellen umleiten und ihre Zytotoxizität verstärken sollen. Weitere Ansätze umfassten eine bessere Zytokinunterstützung durch Ko-Expression eines IL 15-Superagonisten sowie kombinatorische Behandlungsstrategien zur Überwindung von Immunresistenzmechanismen. Der erste Teil dieser Arbeit fokussierte sich dabei auf das Design und die Optimierung von NKG2D CAR-Konstrukten durch Einbau spezifischer Signalstrukturen für NK Zellen. NKG2D ist ein wichtiger aktivierender Rezeptor von NK Zellen, der stressinduzierte NKG2D-Liganden (NKG2DL) erkennt, welche häufig auf Krebszellen hochreguliert sind. In dieser Arbeit wurden sechs verschiedene NKG2D CAR-Varianten mit unterschiedlichen Transmembrandomänen und intrazellulären Signalsequenzen mittels lentiviralem Gentransfer in NK 92 Zellen exprimiert und funktionell charakterisiert. Unter diesen zeigte ein CAR-Konstrukt der sogenannten zweiten Generation (engl., second-generation CAR), das neben der extrazellulären Domäne von NKG2D für die Zielzellerkennung die Transmembrandomäne von NKG2D, die ko stimulatorische Domäne von 2B4 sowie die Signalsequenz von CD3ζ enthielt (NKAR.2, N.N.2B4.z), trotz niedrigerer Oberflächenexpression die höchste zytotoxische Aktivität. Die überlegene Funktionalität dieses NKAR.2-Konstrukts konnte auch in YTS Zellen als weitere NK Zelllinie nachgewiesen werden. Dies bestätigte die größere Bedeutung einer optimalen intrazellulären Signalweiterleitung gegenüber einer erhöhten Rezeptorexpression. In der bisherigen klinischen Anwendung wiesen NKG2D CARs jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit auf. Dies ist möglicherweise auf eine reduzierte Liganden-Expression oder die Freisetzung von proteolytisch prozessierten, löslichen NKG2DL zurückzuführen, was die Erkennung durch NK Zellen erschwert. Daher wurden im folgenden Teil dieser Arbeit pharmakologische Ansätze zur Wiederherstellung oder Verstärkung der Liganden-Expression untersucht. Während der PARP Inhibitor AG 14361 nur eine geringe Erhöhung der NKG2DL-Expression bewirkte und die NK vermittelte Lyse kaum steigerte, führte der HDAC-Inhibitor Panobinostat in mehreren AML Zelllinien zu einer signifikanten Hochregulation von NKG2D-Liganden. Insbesondere Molm 13-Zellen zeigten nach Behandlung mit Panobinostat eine erhöhte Sensitivität gegenüber NK-vermittelter Zytotoxizität, wenngleich dieser Effekt nicht ausschließlich NKG2D-abhängig zu sein schien. Andere Zelllinien wie OCI AML3 erwiesen sich dagegen als resistent gegenüber dieser Strategie, was die ausgeprägte Heterogenität der AML hervorhebt und die Notwendigkeit der Entwicklung weiterer zielgerichteter, aber NKG2DL-unabhängiger Behandlungsansätze unterstreicht. Um die Abhängigkeit von NKG2D-Liganden zu umgehen, wurde das AML-assoziierte Oberflächenmolekül C type lectin like molecule 1 (CLL 1) als alternatives Zielantigen untersucht. CLL 1 wird sowohl auf AML Blasten als auch LSCs exprimiert, jedoch nicht auf gesunden HSCs, was es zu einem vielversprechenden Ziel für selektive AML-Immuntherapien macht. Zur Evaluierung gegen CLL 1 gerichteter Immuntherapien wurden sechs verschiedene CAR-Konstrukte generiert, die drei unterschiedliche Kombinationen von Transmembrandomänen und intrazellulären Signaldomänen (Backbones) enthielten, verbunden mit single chain fragment variable (scFv) Antikörperdomänen der CLL 1-spezifischen Antikörper M26 oder MCLA 117. Alle Konstrukte zeigten nach Expression in NK 92-Zellen ein deutlich erhöhtes zytotoxisches Potenzial gegenüber CLL 1-positiven AML-Zelllinien. Obwohl dabei die von MCLA 117 abgeleiteten Konstrukte im Vergleich zu ihren M26-basierten Gegenstücken eine schwächere Antigenbindung aufwiesen, vermittelten sie eine vergleichbare zytolytische Aktivität. CLL 1-CARs mit dem N.2B4.z-Backbone erwiesen sich wie zuvor im Fall des entsprechenden NKG2D CAR im Vergleich zu den anderen untersuchten Konstrukten als durchweg effektiver hinsichtlich ihrer Effektorfunktionen. Aufgrund dieser überlegenen funktionellen Eigenschaften und der Tatsache, dass der Antikörper MCLA 117 bereits klinisch eingesetzt wird, wurden NK 92/MCLA.N.2B4.z-Zellen für weiterführende Untersuchungen ausgewählt, die Experimente mit primären AML Zellen aus klinischen Patientenproben und Analysen in In-vivo-Modellen einschlossen. Die CAR-modifizierten NK 92 Zellen zeigten dabei im Gegensatz zu parentalen NK 92 Zellen eine ausgeprägte zytotoxische Aktivität gegenüber CLL 1-positiven AML-Zellen. Dies war auch in einem 2D-organotypischen Knochenmarknischenmodell unter immunsuppressiven Bedingungen der Fall. Jedoch führte die Behandlung mit NK 92/MCLA.N.2B4.z-Zellen in einem Xenograft-Mausmodell mit OCI AML2-Zellen weder zu einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums noch zu einem verbesserten Überleben der Tiere. Dies deutet darauf hin, dass weitere Interventionen erforderlich sind, um das immunsuppressive Tumormikromilieu zu überwinden. Zur Verbesserung der Persistenz der NK-Zellen und Verringerung ihrer Abhängigkeit von exogenen Zytokinen wurde ein IL 15-Superagonist (RD IL15) in die lentiviralen CAR-Vektoren integriert und zusammen mit den CARs exprimiert. Diese Modifikation ermöglichte die Proliferation, das Überleben und die Zytotoxizität der CAR NK-Zellen auch ohne die externe Zugabe von IL 2. Zudem konnte die Sekretion von RD IL15 in den Zellüberstand nachgewiesen werden. Entsprechend stellt die Ko-Expression von RD IL15 nicht nur einen vielversprechenden Ansatz zur autokrinen Stimulation von genmodifizierten NK Zellen und Stärkung ihrer Langzeitwirkung dar, sondern bietet auch die Möglichkeit, eine unterstützende Wirkung auf benachbarte Immunzellen auszuüben. In einem parallelen Ansatz wurde ein bispezifischer Antikörper (NKAB CLL 1) entwickelt, der CLL 1-positive Krebszellen erkennen und dabei gleichzeitig NKG2D-exprimierende Effektorzellen aktivieren kann. Dieser Killer Cell Engager, bestehend aus einer CLL 1-spezifischen Bindungsdomäne (MCLA 117 scFv) und einer hochaffinen NKG2D-Bindungsdomäne (Kyk 2.0 scFv) zeigte in der Tat sowohl spezifische Bindung an CLL 1-positive Krebszellen als auch NKG2D-exprimierende Immunzellen (NK, NKT und CD8+ T Zellen). Entsprechend verstärkte NKAB CLL 1 signifikant die Zytotoxizität von PBMCs und primären NK Zellen gegen CLL 1-positive Zielzellen, ohne dabei die gegenseitige Lyse (Fratricide) von NK-Zellen auszulösen, die nach Zytokin-Expansion selbst CLL 1 hochregulieren. AML Zellen können sowohl über direkte Zell-Zell-Kontakte als auch durch lösliche Faktoren die Expression von NKG2D auf NK Zellen herunterregulieren. Dieser Escape-Mechanismus wäre im Fall eines von endogenem NKG2D abhängigen Therapieansatzes problematisch, könnte jedoch durch die Kombination von NKG2D CAR NK 92 Zellen und NKAB CLL 1 überwunden werden. In der Tat vermittelte NKAB CLL 1 eine deutlich erhöhte Zytotoxizität von NKAR.2-exprimierenden NK 92 Zellen gegen CLL 1-posititve AML-Zelllinien. Zudem führte die Kombination von NKAR.2 NK 92-Zellen und NKAB CLL 1 auch zu einer effektiven Lyse von primären AML-Blasten, die gegenüber NKAR.2 NK 92 Zellen ohne Zugabe des bispezifischen Moleküls resistent waren. In einem systemischen Xenograft-Mausmodell verzögerte die Kombinationstherapie die Leukämieprogression und verlängerte signifikant das Überleben der Tiere, wobei ein Großteil der Tiere während des Beobachtungszeitraums symptomfrei blieb. Im Gegensatz dazu zeigten NKAR.2 NK 92 Zellen allein im Vergleich zu unmodifizierten NK 92 Zellen keine Wirksamkeit, was den entscheidenden Beitrag des bispezifischen Killer Cell Engagers zum Therapieerfolg unterstreicht. Vor dem Hintergrund der ausgeprägten Tumorheterogenität bei AML und des möglichen Therapie-induzierten Verlustes von Zielantigenen als Mechanismus des Immun-Escape leukämischer Zellen wurde ein modularer Dual Targeting-Ansatz implementiert. Dabei kamen NKG2D CAR-exprimierende NK Zellen in Kombination mit NKAB CLL 1 und einem CD19-spezifischen NKAB CD19 Molekül zum Einsatz. Dies ermöglichte die selektive Eliminierung heterogener Zellpopulationen, die CLL 1 und/oder CD19 exprimierten. Die Aktivierung von Effektorzellen war hierbei strikt antigenabhängig, und unerwünschte on target/off tumor-Effekte waren minimal. Das modulare Prinzip konnte auch erfolgreich auf B-Zell-Erkrankungen übertragen werden. Dabei führte die Kombination von CD19- und CD20-spezifischen NKAB-Molekülen mit NKAR.2 NK 92-Zellen zu einer ausgeprägten Zytotoxizität gegenüber B-Zell-Leukämie- und Lymphomzelllinien. Auch in einem Xenograft-Mausmodell mit Raji-Lymphomzellen resultierte die Behandlung mit NKAR.2 NK 92-Zellen in Kombination mit NKAB-CD19 oder NKAB-CD20 in einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums und einem verlängerten Überleben der Tiere, was das therapeutische Potenzial dieses Ansatzes weiter untermauert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die erfolgreiche Entwicklung hoch wirksamer und spezifischer NK-Zell-basierter Immuntherapien durch die gezielte Optimierung von CAR-Konstrukten für NK Zellen, die Unterstützung der Effektorzellen durch gleichzeitige Zytokinexpression sowie die zielgerichtete Umlenkung ihrer Aktivität durch bispezifische Killer Cell Engager. Die Kombination dieser Strategien ermöglichte die Umgehung zentraler Immun-Escape-Mechanismen wie dem Verlust der Expression von Zielantigenen in Krebszellen und der Hemmung der Effektorzellen. Dies führte zu einer ausgeprägten anti-tumoralen Wirkung in präklinischen Modellen der AML und von B Zell-Leukämien und Lymphomen. Die hier gewonnenen Erkenntnisse bilden damit eine solide Grundlage für die weitere Entwicklung experimenteller NK-Zelltherapien für die Behandlung der AML und anderer maligner hämatologischer Erkrankungen.