The FuN Screen – A Versatile High-Throughput Assay for Nanopore Engineering

In recent years, nanopores have become an important tool in biotechnology especially in biosensing and DNA sequencing. The capacity to engineer nanopores with tailored properties and functions is key to their biotechnological development and provides new fundamental insight into their mechanisms of action. To date, most construction efforts have been realised with rational, structure-guided approaches while genetic screening systems are not widely used. Addressing this technological gap, a genetic reporter assay was developed based on genetically-encoded fluorescent protein sensors to enable a highresolution, quantitative read out of nanopore function in E. coli. The capacity of this assay was demonstrated by dissecting molecular features and functions of the bacteriophage pinholin S21-68 in highresolution genetic screens on different platforms and complemented with high-resolution electrical recordings. This class of membrane peptides is part of the bacteriophage life cycle and very efficient in cell lysis initiation. Detailed analysis of the first transmembrane domain revealed key functions of single amino acids with positively charged residues as main regulators of nanopore stabilization. In addition, several different nanopores were tested with this system and demonstrated the expandability of the screen for further application.

In den letzten Jahren sind Nanoporen zu einem wichtigen Werkzeug in der Biotechnologie geworden, vor allem in der Biosensorik und DNA-Sequenzierung. Die Fähigkeit Nanoporen mit maßgeschneiderten Eigenschaften und Funktionen zu konstruieren, ist der Schlüssel zu ihrer biotechnologischen Entwicklung und liefert neue grundlegende Erkenntnisse über ihre Wirkungsmechanismen. Bis heute wurden die meisten konstruierten Nanoporen mit rationalen, struktur-basierten Ansätzen realisiert, während genetische Durchmusterungsverfahren nicht weit verbreitet sind. Um diese technologische Lücke zu schließen, wurde ein Durchmusterungsverfahren entwickelt, das auf genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinsensoren basiert und eine hochauflösende und quantitative Analyse der Funktion von Nanoporen in E. coli ermöglicht. Die Leistungsfähigkeit dieses Verfahrens wurde durch die Analyse molekularer Merkmale und Funktionen des Bakteriophagen Pinholins S21-68 in hochauflösenden genetischen Durchmusterungen auf verschiedenen Plattformen demonstriert und durch hochauflösende elektrische Aufzeichnungen ergänzt. Diese Klasse von Membranpeptiden ist Teil des Lebenszyklus des Bakteriophagen und sehr effizient bei der Initiierung der Zelllyse. Die detaillierte Analyse der ersten Transmembrandomäne demonstrierte die Schlüsselfunktionen einzelner Aminosäuren, bei denen vor allem positiv geladene Reste zur Nanoporen Stabilisierung beitragen. Darüber hinaus wurden mehrere verschiedene Nanoporen mit diesem System getestet, um die Erweiterbarkeit des Verfahrens für weitere Anwendungen zu zeigen.