Entwicklung bispezifischer Antikörper für die zielgerichtete Eliminierung von Tumorzellen durch natürliche Killerzellen

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) besitzen die Fähigkeit, virusinfizierte oder entartete Zellen gezielt zu eliminieren. Eine zentrale Bedeutung in der Erkennung pathologisch veränderter Zellen kommt dabei dem aktivierenden Rezeptor Natural Killer Group 2D (NKG2D) zu, welcher nach Bindung an stressinduzierte NKG2D-Liganden (NKG2D-L) auf der Oberfläche maligner Zellen die Aktivierung von NK-Zellen vermittelt. Der anhaltende Selektionsdruck einer fortwährenden Immunabwehr kann jedoch die Etablierung von Tumorzellvarianten fördern, die aufgrund unterschiedlicher Mechanismen wie zum Beispiel der proteolytischen Freisetzung von NKG2D-L einer NKG2D-basierten Erkennung entgehen. Um solchen Evasionsmechanismen entgegenzuwirken, wurde im Vorfeld dieser Arbeit ein modulares System etabliert, das sich aus einem bispezifischen Antikörper mit Selektivität für das Tumor-assoziierte Antigen ErbB2 (HER2) und NKG2D (NKAB-ErbB2) sowie genetisch modifizierten NK-92-Zellen mit einem NKG2D-basierten chimären Antigenrezeptor (NKAR) zusammensetzt. Die Expression des NKAR in den NK-Zellen vermittelte dabei die zytotoxische Aktivität gegenüber Liganden-positiven Tumorzellen, die in Anwesenheit von NKAB-ErbB2 gegenüber ErbB2-exprimierenden Brustkrebszellen weiter gesteigert wurde. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieser Kombinationsansatz durch die ektopische Expression des immunmodulatorischen IL-15 Superagonisten RD-IL15 in NKAR-NK-92 Zellen weiter optimiert. Die durchgeführten in vitro Untersuchungen belegten, dass sekretiertes RD-IL15 die Proliferation und Aktivität der Produzentenzellen in autokriner und umgebender primärer Immunzellen in parakriner Weise stimuliert. Ein weiteres wichtiges Ziel der Arbeit war das NKAB/NKAR-System um bispezifische Antikörper-Moleküle mit Selektivität für weitere Zielantigene solider Tumoren und hämatologischer Krebserkrankungen zu erweitern. Die hierzu generierten NKAB-Moleküle NKAB-EGFR (Epidermal growth factor receptor), NKAB-CD19 und NKAB-CD20 erwiesen sich als hoch aktiv und vermittelten die spezifische Lyse Zielantigen-exprimierender Tumorzellen durch primäre NK-Zellen und NKAR-NK-92 Derivate. NKAB-ErbB2 und NKAB-EGFR wurden zusätzlich in Kombination gegenüber Gliomzellen erprobt, die ErbB2 und EGFR oder die EGFR-Mutante EGFRvIII exprimieren. Sowohl in Gegenwart eines als auch zweier NKAB-Moleküle wurde dabei eine effektive Lyse der Zielzellen durch NKAR-NK-92 Derivate erzielt. Nachfolgend wurde untersucht, ob die Kombination der beiden NKAB-Moleküle auch geeignet ist, der klinischen Situation entsprechende Tumorpopulationen mit heterogener Antigenexpression (ErbB2 oder EGFR/EGFRvIII) gezielt zu eliminieren. Zusammen eingesetzt führten NKAB-ErbB2 und NKAB-EGFR dabei mit NKAR-Effektorzellen zur effizienten Eliminierung der Tumormischkulturen. Der alleinige Einsatz von NKAB-EGFR oder NKAB-ErbB2 vermittelte hingegen lediglich die Abtötung der jeweiligen, das relevante Zielantigen exprimierenden Tumorzell-Subpopulation. Die in dieser Arbeit erhobenen Daten weisen damit eine hochspezifische und sehr effektive antitumorale Aktivität des weiter optimierten modularen Systems gegenüber Zielantigen-exprimierenden Tumorzellen nach. Dies rechtfertigt eine weitere präklinische Entwicklung dieses Ansatzes mit dem Ziel eines zukünftigen Einsatzes in klinischen Studien.

As part of the innate immune system, natural killer (NK) cells are able to specifically eliminate virus-infected or abnormal cells without prior sensitization. The activating receptor Natural Killer Group 2D (NKG2D) plays an essential role in this process by binding to stress-induced NKG2D ligands (NKG2D-L) on the surface of malignant cells, thereby mediating NK-cell activation. However, tumor cells can evade NKG2D-mediated immune surveillance by downregulating or shedding NKG2D-L. To counteract such escape mechanisms, our group previously established a modular system consisting of a bispecific antibody binding to the tumor-associated antigen ErbB2 (HER2) and NKG2D (NKAB-ErbB2), and NK-92 cells engineered with an NKG2D-based chimeric antigen receptor (NKAR). Expression of the NKAR receptor on NK cells mediated cytotoxic activity against ligand-positive tumor cells, which was further enhanced against ErbB2-expressing breast cancer cells in the presence of NKAB-ErbB2. In this thesis project, the combination therapy was further optimized by ectopic expression of the immunomodulatory IL-15 superagonist RD-IL15 in NKAR-NK-92 cells. Secreted RD-IL15 stimulated proliferation and activity of both, the producer cells and surrounding primary immune cells in an autocrine and paracrine manner. Another important goal of this study was to extend the NKAB/NKAR system with bispecific molecules targeting other tumor-associated antigens expressed by solid tumors and hematological malignancies. These newly established NKAB molecules NKAB-EGFR (targeting epidermal growth factor receptor), as well as NKAB-CD19 and NKAB-CD20 targeting B-cell malignancies potently mediated specific lysis of target antigen-expressing tumor cells by primary NK cells and NKAR-NK-92 derivatives. In addition, NKAB-ErbB2 and NKAB-EGFR were tested in combination against glioma cells expressing ErbB2 and EGFR, or ErbB2 and the EGFR mutant EGFRvIII. In the presence of either one or both NKAB molecules, effective lysis of target cells by NKAR-NK-92 variants was achieved. Subsequently, a mixed tumor cell model more closely mimicking a clinically relevant setting was established to analyze whether the combination of the two NKAB molecules could also eliminate tumor populations with heterogeneous antigen expression (ErbB2 or EGFR/EGFRvIII). Thereby, only the combination of both, NKAB-ErbB2 and NKAB-EGFR with NKAR effector cells resulted in efficient elimination of the heterogeneous tumor cell population. In contrast, NKAB-EGFR or NKAB-ErbB2 alone only mediated killing of the tumor cell subpopulation expressing the respective target antigen. Taken together, the results of this study demonstrate the highly specific and effective antitumor activity of the optimized modular NKAB/NKAR system against target antigen-expressing tumor cells. This justifies further preclinical development of this approach, with the perspective of future clinical translation.