Circumventing glycosylation in heterologous cannabinoid production

Throughout the ages, the Cannabis plant has been used either as a source of fibre, nutrition or for medicinal and recreational use. For the latter aspects, the phytocannabinoids are responsible. A class of metabolites, originally found in C. sativa, that interact with the endocannabinoid system, which is associated with the reward system in the brain. As part of their pharmacological activity, they have been found to modulate pain and hunger, have anti inflammatory and anti tumour properties and show psychotropic effects. While a plethora of different phytocannabinoids is produced by the plant, the most abundant are Δ9 tetrahydrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD) and their common precursor cannabigerolic acid (CBGA). While most of the pharmacological spectrum is highly desirable, the psychoactive properties of THC are considered a major limitation for clinical use. This causes the high pharmacological potential of this species to still be largely unharnessed, as non psychoactive phytocannabinoids only have a low yield in the plant and are difficult to separate from the psychoactive THC. As chemical production of synthetic cannabinoids is costly, biological production in heterologous host systems could provide a suitable avenue to produce specific, desired cannabinoids. This would not only enable industrial scale production of rare or novel cannabinoids as pharmaceuticals but could also decrease regulatory hurdles associated with Cannabis cultivation. Previous research aiming for the heterologous production of cannabinoids can broadly be classified according to the used host organism and all encounter different challenges. First is bacterial production, with E. coli being the first host with whom heterologous production of THCA and CBGA has been successful. Unfortunately, the combination of a low yield due to a low precursor supply of GPP and observed antibacterial activity of cannabinoids makes this host unsuitable for large scale industrial production. Second are yeasts and with them, heterologous production could also be successfully shown. While the yield is much better compared to bacterial production, a high degree of metabolic engineering was necessary to achieve mediocre amounts of cannabinoids. Especially the supply of GPP had to be massively improved. Additionally, cytotoxic activity has been observed again, limiting the potential yield of the desired compounds. Plants on the other hand offer the potential of compartmentalization and can provide higher quantities of GPP as a precursor. While the production of OA and the downstream conversion of CBGA to specific cannabinoids like THC and CBD has been shown, so far, no production of CBGA from OA and GPP has been successfully performed in plants. Instead, the produced OA is glucosylated and not prenylated. This study aims to close this last bottleneck in the reaction cascade to achieve heterologous cannabinoid production in planta. Two different core methods are utilized to achieve the desired CBGA formation, one being stable chloroplast transformation in N. tabacum cv. petit Havana and the other being Agrobacterium mediated transient gene expression in N. benthamiana. Advantages of chloroplast transformation include the absence of small molecule glycosylation, precursor availability in the form of hexanoic acid and GPP and high transgenic protein accumulation. The main disadvantage of this method lies in the time needed to generate stable transformed plants which can be used for testing. Transient expression on the other hand generates a much smaller timeframe for experimental procedures, allowing more parameters to be tested. As part of this study tested combinations include cytosolic or chloroplast enzyme localization, an increase of the intracellular GPP supply, metabolic channelling using the SpyTag/SpyCatcher system, and identification and addition of a β glucosidase from C. sativa. Neither using stable chloroplast transformation, nor any variant using transient gene expression was sufficient to achieve CBGA production in planta. For chloroplasts, no integration event of the expression cassette could be observed, prohibiting the production of the desired compounds or any intermediates. For transient transformation, neither enhancement of the intracellular GPP pool, nor metabolic channelling was enough to achieve CBGA formation. In all samples, the reaction seemed to halt due to the glucosylation of OA to form OA Glc. Literature suggested that this loss of available intermediate due to glucosylation does not occur in the original host and is a side effect of heterologous expression in Tobacco spp. Nevertheless, we found that OA Glc is also present in C. sativa in a much higher quantity than free OA. We then identified five different potential β-glucosidases from transcriptomic data which could be responsible for the cleavage of OA-Glc in C. sativa and thus reintroduce OA to the pathway. One of the five candidates, namely the vicianin hydrolase like enzyme (CsVH), showed a positive impact on the intracellular supply of free OA and was able to raise the concentration to a similar level compared to the tested C. sativa cultivars. Nevertheless, prenylation of OA to form CBGA could still not be observed. Literature suggests no intermediates or other routes of production than direct prenylation of OA with GPP to form CBGA in C. sativa. Especially since pathway reconstruction in bacteria and yeast has been successful under this assumption, the biosynthesis route was believed to be fully elucidated. Nevertheless, as part of this study, both OA-Glc and free OA were found in the original host with a clear imbalance towards the glycosylated form. Additionally, the identification of a glucosidase from C. sativa with a positive impact on the intracellular concentration of free OA in Tobacco was possible, thus OA Glc cleavage activity of this enzyme is assumed. Further testing of said enzyme is necessary to verify the observed in planta activity and its importance for phytocannabinoid biosynthesis. The former can be done using in vitro enzyme characterization and the latter by gene silencing and subsequent measuring for a change in phytocannabinoid content. Even though production of the desired compound CBGA was not successful, by identifying CsVH an important step towards heterologous cannabinoid production in planta was made. The presence of OA Glc in C. sativa suggests that the phytocannabinoid production pathway must be updated to account for this intermediate. Additionally, even though further testing is still necessary, CsVH must be added as potentially responsible for the cleavage reaction and reintroduction of OA into the pathway.

Die Verwendung von Cannabis im Laufe der Jahrhunderte reichte von einer Nährstoffquelle, über Fasern hin zu medizinischen Anwendungen. Für Letzteres sind die Phytocannabinoide verantwortlich. Diese ursprünglich in Cannabis vorkommenden Metaboliten interagieren mit dem Endocannabinoid-System, das wiederum mit dem Belohnungssystem des Gehirns assoziiert ist. Ihre pharmakologische Wirkung moduliert unter anderem Schmerz und Hunger, wirkt entzündungs und tumorhemmend und zeigt psychotrope Effekte. Die Pflanze produziert eine Vielzahl verschiedener Phytocannabinoide, am häufigsten sind jedoch Δ9 Tetrahydrocannabinol (THC), Cannabidiol (CBD) und deren gemeinsame Vorstufe Cannabigerolsäure (CBGA). Obwohl das breite pharmakologische Spektrum größtenteils erwünscht ist, gelten die psychoaktiven Eigenschaften von THC als wesentliche Einschränkung für die klinische Anwendung. Diese Eigenschaften sind ebenfalls der Grund, warum Cannabis stärker als Freizeitdroge assoziiert wird. Dies führt dazu, dass das hohe pharmakologische Potenzial von Cannabis noch nicht ausgeschöpft wird, da nicht-psychoaktive Phytocannabinoide in der Pflanze nur in geringer Menge vorhanden sind und sich nur schwer vom psychoaktiven THC trennen lassen. Da die chemische Produktion synthetischer Cannabinoide kostspielig ist, könnte die biologische Produktion in heterologen Wirtssystemen einen geeigneten Weg zur Herstellung spezifischer, gewünschter Cannabinoide bieten. Dies würde nicht nur die industrielle Produktion seltener oder neuartiger Cannabinoide als Pharmazeutika ermöglichen, sondern auch regulatorische Hürden im Zusammenhang mit dem Cannabisanbau verringern. Frühere Forschungen zur heterologen Produktion von Cannabinoiden lassen sich nach dem verwendeten Wirtsorganismus klassifizieren und stoßen jeweils auf unterschiedliche Herausforderungen. Zunächst ist die bakterielle Produktion zu nennen, wobei E. coli der erste Wirt ist, in dem die heterologe Produktion von THCA und CBGA erfolgreich war. Leider macht die Kombination aus geringer Ausbeute aufgrund einer geringen GPP-Versorgung und der antibakteriellen Aktivität der Cannabinoide diesen Wirt für die großtechnische Produktion ungeeignet. Danach sind Hefen zu nennen, mit denen ebenfalls eine heterologe Produktion erfolgreich nachgewiesen werden konnte. Obwohl die Ausbeute im Vergleich zur bakteriellen Produktion deutlich besser ist, war ein hohes Maß an Metabolic Engineering erforderlich, um mittelmäßige Mengen an Cannabinoiden zu erreichen. Insbesondere die GPP-Versorgung musste massiv verbessert werden. Darüber hinaus wurde erneut zytotoxische Aktivität beobachtet, was die maximale potenzielle Ausbeute begrenzt. Pflanzen hingegen bieten die Möglichkeit zur Kompartimentierung und können höhere Mengen an GPP als Vorstufe bereitstellen. Während sowohl die Produktion von OA als auch die anschließende Umwandlung von CBGA in spezifische Cannabinoide wie THC und CBD nachgewiesen wurden, gelang die heterologe Produktion von CBGA aus OA und GPP in planta bisher nicht. Stattdessen ist das produzierte OA glucosyliert und nicht prenyliert. Ziel dieser Studie ist es, diesen letzten Engpass in der Reaktionskaskade zu schließen, um eine heterologe Produktion von Cannabinoiden in Pflanzen zu erreichen. Um die gewünschte CBGA-Bildung zu erreichen, werden zwei verschiedene Kernmethoden eingesetzt: die stabile Chloroplastentransformation in N. tabacum cv. Petit Havana und die Agrobakterium-vermittelte transiente Genexpression in N. benthamiana. Vorteile der Chloroplastentransformation sind das Fehlen niedermolekularer Glykosylierung, die Verfügbarkeit von Vorläufern in Form von Hexansäure und GPP sowie eine hohe transgene Proteinakkumulation. Der Hauptnachteil dieser Methode liegt in der benötigten Zeit zur Erzeugung stabiler transformierter Pflanzen, die für Tests verwendet werden können. Die transiente Expression hingegen ermöglicht einen deutlich kürzeren Zeitrahmen für experimentelle Verfahren, wodurch der Einfluss von mehr Parametern getestet werden kann. Im Rahmen dieser Studie wurden verschiedene Kombinationen getestet, darunter die zytosolische oder Chloroplasten-Enzymlokalisation, eine Erhöhung der intrazellulären GPP Zufuhr, metabolische Kanalisierung mittels des SpyTag/SpyCatcher-Systems sowie die Identifizierung und Zugabe einer β Glucosidase aus Cannabis. Weder die stabile Chloroplastentransformation noch eine Variante mit transienter Genexpression reichten aus, um eine CBGA-Produktion in planta zu erreichen. Bei ersterem konnte keine Integration der Expressionskassette beobachtet werden, was die Produktion der gewünschten Verbindungen oder jeglicher Zwischenprodukte verhinderte. Bei den transienten Ansätzen reichten weder eine Erhöhung des intrazellulären GPP Pools noch eine metabolische Kanalisierung aus, um die CBGA-Bildung zu erreichen. In allen Proben schien die Reaktion aufgrund der Glukosylierung von OA zu OA Glc zu stoppen. Die Literatur deutet darauf hin, dass dieser Verlust des verfügbaren Zwischenprodukts durch Glukosylierung im ursprünglichen Wirt nicht auftritt und eine Nebenwirkung der heterologen Expression in N. benhtamiana ist. Jedoch fanden wir heraus, dass OA Glc auch in Cannabis vorkommt, und zwar in einer viel höheren Menge als freies OA. Anschließend identifizierten wir anhand der transkriptomischen Daten fünf verschiedene potenzielle β Glucosidasen, die für die Spaltung von OA Glc in Cannabis verantwortlich sein und OA somit wieder in den Stoffwechselweg einführen könnten. Einer der fünf Kandidaten, das Vicianinhydrolase-ähnliche Enzym (CsVH), zeigte einen positiven Einfluss auf die intrazelluläre Versorgung mit freiem OA und konnte die Konzentration im Vergleich zu den getesteten Cannabisproben auf ein ähnliches Niveau anheben. Eine Prenylierung von OA zu CBGA konnte jedoch nicht beobachtet werden. Die Literatur deutet auf keine Zwischenprodukte oder andere Produktionswege als die direkte Prenylierung von OA mit GPP zu CBGA in Cannabis hin. Da die Rekonstruktion des Stoffwechselwegs in Bakterien und Hefen unter dieser Annahme erfolgreich war, galt der Biosyntheseweg als vollständig aufgeklärt. Im Rahmen dieser Studie wurden jedoch sowohl OA Glc als auch freie OA im ursprünglichen Wirt gefunden, mit einem deutlichen Ungleichgewicht zugunsten der glykosylierten Form. Darüber hinaus konnte eine Glucosidase aus Cannabis mit positivem Einfluss auf die intrazelluläre Konzentration von freier OA in Tabak identifiziert werden, sodass von einer OA Glc-Spaltungsaktivität dieses Enzyms ausgegangen wird. Weitere Tests dieses Enzyms sind notwendig, um die beobachtete Aktivität in der Pflanze und ihre Bedeutung für die Phytocannabinoid-Biosynthese zu bestätigen. Erstere kann durch in-vitro-Enzymcharakterisierung erfolgen, letztere durch Gen-Silencing in Cannabis und Messung einer Veränderung des Phytocannabinoid-Gehalts. Obwohl die Produktion der gewünschten Verbindung CBGA nicht erfolgreich war, wurde durch die Identifizierung von CsVH ein wichtiger Schritt in Richtung heterologer Cannabinoid-Produktion in der Pflanze gemacht. Das Vorkommen von OA Glc in Cannabis legt nahe, dass der Phytocannabinoid-Produktionsweg aktualisiert werden muss, um dieses Zwischenprodukt zu berücksichtigen. Zusätzlich muss, obwohl weitere Tests noch notwendig sind, CsVH als potenziell verantwortlich für die Spaltungsreaktion und die Wiedereinführung von OA in den Stoffwechselweg hinzugefügt werden.