Design and development of dextran-drug conjugates for enhanced tumour targeting

In recent decades the antibody-drug-conjugate (ADC) field has flourished, bringing Paul Ehrlich’s “magic-bullet” concept from vision toward practice. Designer antibodies — equipped with masking domains, bispecific formats or Fragment crystallizable region (Fc) engineering — now complement sophisticated peptide chemistry that incorporates canonical and non-natural amino acids, yielding increasingly potent and precise agents. However, malignant and healthy cells share most surface antigens, so absolute tumour selectivity with minimal systemic toxicity remains elusive. A promising corrective is to shift the therapeutic focus from the cancer cell to the tumour micro-environment and to distribute the disparate demands of targeting, immune activation and cytotoxicity across a modular system. Such a multicomponent strategy requires a linker scaffold that is water-compatible, metabolically benign and endowed with orthogonal binding sites. The scaffold must support stable attachment of diverse payloads, present them multivalently to enhance avidity and, ideally, extend in vivo half-life without compromising safety. By allocating distinctive chemical handles to separate regions of the linker, one can attach small-molecule warheads, functional peptides and antibodies in controlled ratios, tuning solubility, stability and biological activity independently. In this way selectivity, potency and pharmacokinetics — rarely optimised simultaneously in a single molecule — can be orchestrated cooperatively within an integrated architecture. This doctoral dissertation presents a comprehensive study on modular ADCs that exploit a dextran carrier to unite tumour targeting, immune activation and cytotoxic delivery within a single, tuneable platform. Key design challenges — selectivity, multivalency, metabolic stability and orthogonality — are addressed through deliberate scaffold engineering. Dextran was selected as the linker because of it is water-compatible, biodegradable and amenable to precise chemical modification. A diamine cadaverine was installed at the reducing end, furnishing a microbial-transglutaminase (MTG) handle for site-specific antibody coupling, while carboxyethylation of the repeating units introduced multiple azide sites for copper-catalysed click reaction of small-molecule or peptide payloads. These complementary chemical strategies permit independent optimisation of each functional moiety, allowing ligand identity, valency and pharmacokinetics to be refined without mutual compromise. Starting from the dextran scaffold, three conjugates — each exploiting a distinct biological entry point — were conceived, synthesised and evaluated. The first compound employs PKT16, a thrombospondin-1 derived 16-mer that can trigger regulated cell death via the cluster-of-differentiation 47 (CD47) receptor. This was chosen since a trivalent PKT16-dextran conjugate had already shown improved selectivity. The new architecture raises the valency to eight PKT16 moieties while adding trastuzumab to direct the payload to cells that over-express human epidermal growth-factor receptor 2 (HER2). In this design the antibody brings the carrier to the tumour, the peptide blocks the macrophage-CD47 interaction that normally delivers a “don’t-eat-me” signal, and simultaneous CD47 activation elevates reactive-oxygen-species production to induce regulated cell death. The PKT16-containing compounds were examined in both cell‑binding and cell-proliferation assays. To study the influence of PKT16 valency, a multivalent dextran-PKT16 compound (eight PKT16 moieties attached to dextran) was compared with a monovalent PKT16 peptide (a solitaire PKT16). When the monovalent fluorescent PKT16-TAMRA compound was used in the cell-binding assay, it showed concentration‑dependent, non-specific binding.

As TAMRA could contribute to off-target binding, the cell-proliferation assay was performed without the fluorophore. However, even in the cell-proliferation assay, the monovalent PKT16 peptide showed concentration-dependent killing of Chinese hamster ovary (CHO) cells, which lack CD47 and other human receptors. This confirmed that the observed cytotoxicity in the proliferation assay came from the monovalent PKT16 peptide itself rather than from TAMRA. Thus, even if the TAMRA had an influence on the binding assay — which is difficult to determine as most chromophores can contribute to unspecific binding — it did not influence the unspecific binding and killing observed in the cell proliferation assay. These observations suggest a non-receptor-mediated mechanism for the monovalent PKT16 peptide, possibly due to its ability to bind cell membranes and induce stress responses rather than specifically target CD47. Future work could reinstate CD47 selectivity by re-engineering the PKT16 sequence— returning to the native thrombospondin-1 motif to determine the cause of the unspecific binding — and optimizing the systemic half-life to prevent release of long-lived, membrane-active fragments. Given CD47s broad expression, the in vivo use of any multivalent dextran-PKT16 compound must be monitored closely to avoid non-receptor-mediated toxicity. The second conjugate aims to target fibroblast activation protein (FAP), a membrane protease highly expressed on cancer-associated fibroblasts yet virtually absent from normal adult tissues. Early work centred on FAPi-46, but it was superseded by oncoFAP, a more selective and synthetically accessible inhibitor. A range of valency was used to click the azide-tagged oncoFAP onto the alkyne-functionalized dextran backbone, occasionally the 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) was incorporated to provide traceability. In murine biodistribution studies the conjugate accumulated strongly in FAP-rich tumours and demonstrated rapid hepatobiliary and renal clearance. The fluorescence detected in brain tissue showed that the compound may have crossed the blood–brain barrier (BBB), suggesting that, with careful tuning of oncoFAP valency and overall molecular size, the platform could potentially deliver compact cytotoxins such as monomethyl auristatin E (MMAE) to gliomas, a cancer type largely impervious to conventional drugs. A dextran conjugate bearing the Toll-like-receptor-7/8 (TLR7/8) agonist (T785) was planned as the last conjugate, aiming to elicit a local innate-immune response while remaining quiescent in the bloodstream. An immunoglobulin G1 (IgG) on the scaffold was masked at its Fc domain with a cleavable linker. In circulation this mask prevents Fcγ-receptor (FcγR) binding; inside the protease-rich tumour micro-environment (TME) it is removed, macrophages bind the exposed Fc, internalise the conjugate, and deliver T785 to endolysosomes where it engages TLR7/8, triggering interleukin and tumour-necrosis-factor-α (TNF-α) release. In macrophage-like THP-1 cells the masked compound was inert, whereas the unmasked form produced a robust TNF-α surge, confirming that protease-dependent gating works as intended. Planned studies will first quantify internalisation kinetics in tumour–macrophage co-cultures. Pending toxicology data, the next step will be a thirty-day tumour-suppression experiment in xenograft mouse models. Although these in vivo tests fall outside the present dissertation, the T785-dextran design already demonstrates the key requirement: robust, tumour-restricted immune activation with minimal systemic inflammation. Collectively, these results validate dextran as a versatile, orthogonally functionalised scaffold capable of carrying diverse payloads while preserving biological activity. Future work will focus on optimising linker stability, scaling GMP synthesis, and progressing the most advanced candidates into formal toxicology and efficacy studies.

In den letzten Jahrzehnten hat sich der Bereich der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC) rasant entwickelt und Paul Ehrlichs Konzept der „Wunderwaffe“ wurde von der Vision in die Praxis umgesetzt. Designer-Antikörper – ausgestattet mit Maskierungsdomänen, bi-spezifischen Formaten oder Fragment crystallizable region (Fc)-Engineering – ergänzen nun die hochentwickelte Peptidchemie, die kanonische und nicht-natürliche Aminosäuren einbezieht, und führen zu immer wirksameren und präziseren Wirkstoffen. Allerdings weisen bösartige und gesunde Zellen die meisten Oberflächenantigene gemeinsam auf, sodass eine absolute Tumourselektivität bei minimaler systemischer Toxizität nach wie vor schwer zu erreichen ist. Eine vielversprechende Korrektur besteht darin, den therapeutischen Fokus von der Krebszelle auf die Tumourmikroumgebung zu verlagern und die unterschiedlichen Anforderungen an Targeting, Immunaktivierung und Zytotoxizität auf ein modulares System zu verteilen. Eine solche Mehrkomponentenstrategie erfordert ein Linker-gerüst, das wasserverträglich, metabolisch unbedenklich und mit orthogonalen Bindungsstellen ausgestattet ist. Das Gerüst muss die stabile Anlagerung verschiedener Wirkstoffe unterstützen, diese multivalent präsentieren, um die Avidität zu erhöhen und idealerweise die Halbwertszeit in vivo verlängern, ohne die Sicherheit zu beeinträchtigen. Durch die Zuweisung unterschiedlicher chemischer Anknüpfungspunkte zu verschiedenen Bereichen des Linkeres können kleine Moleküle, Peptide und Antikörper in kontrollierten Verhältnissen angeknüpft werden somit der Option, die Löslichkeit, Stabilität und biologische Aktivität unabhängig voneinander einzustellen. Auf diese Weise können Selektivität, Wirksamkeit und Pharmakokinetik – die selten gleichzeitig in einem einzigen Molekül optimiert werden können – innerhalb einer integrierten Architektur kooperativ aufeinander abgestimmt werden. Diese Doktorarbeit präsentiert eine umfassende Studie über modulare ADCs, die einen Dextran-Träger nutzen, um Tumour-Targeting, Immunaktivierung und zytotoxische Wirkstoffabgabe in einer einzigen, anpassbaren Plattform zu vereinen. Die wichtigsten Herausforderungen beim Design – Selektivität, Multivalenz, metabolische Stabilität und Orthogonalität – werden durch gezieltes Scaffold-Engineering angegangen. Dextran wurde als zentraler Linker ausgewählt, da es wasserkompatibel, biologisch abbaubar und für präzise chemische Modifikationen geeignet ist. An das reduzierende Ende wurde ein Diamin-Kadaverin angebracht, das einen mikrobiellen Transglutaminase (MTG) Erkennung für die ortsspezifische Antikörperkopplung bereitstellt, während die Carboxyethylierung der sich wiederholenden Einheiten mehrere Azid stellen für die kupferkatalysierte Click-Reaktion von kleinen Molekülen oder Peptid-Nutzlasten einführte. Diese komplementären chemischen Strategien ermöglichen eine unabhängige Optimierung jeder funktionellen Einheit, sodass die Identität, Valenz und Pharmakokinetik des Liganden ohne gegenseitige Kompromisse verfeinert werden können. Ausgehend vom Dextran-Gerüst wurden drei Konjugate – jedes mit einem unterschiedlichen biologischen Ansatzpunkt – konzipiert, synthetisiert und evaluiert. Die erste Verbindung nutzt PKT16, ein von Thrombospondin-1 abgeleitetes 16-mer, das über den Cluster of Differentiation 47 (CD47)-Rezeptor einen regulierten Zelltod auslösen kann. Da ein dreiwertiges PKT16-Dextran-Konjugat bereits eine verbesserte Selektivität gezeigt hatte, erhöht die neue Architektur die Valenz auf acht PKT16-Einheiten und fügt Trastuzumab hinzu, um das Peptid zu Tumour-Zellen zu leiten, die den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) überexprimieren.

Bei diesem Design bringt der Antikörper den Träger zum Tumour, das Peptid blockiert die CD47-Interaktion der Makrophagen, die normalerweise ein „Don't eat me”-Signal aussendet, und die gleichzeitige CD47-Aktivierung erhöht die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, um den regulierten Zelltod zu induzieren. Die PKT16-haltigen Verbindungen wurden sowohl in Zellbindungs- als auch in Zellproliferationstests untersucht. Um den Einfluss der Valenz von PKT16 zu untersuchen, wurde eine multivalente Dextran-PKT16-Verbindung (acht an Dextran gebundene PKT16-Einheiten) mit einem monovalenten PKT16-Peptid (ein einzelnes PKT16) verglichen. Bei Verwendung der monovalenten fluoreszierenden PKT16-TAMRA-Verbindung im Zellbindungs-assay zeigte sich eine konzentrationsabhängige, unspezifische Bindung. Da TAMRA zu einer Off-Target-Bindung beitragen könnte, wurde der Zellproliferations-assay ohne Fluorophor durchgeführt. Selbst im Zellproliferationstest zeigte das monovalente PKT16-Peptid jedoch eine konzentrationsabhängige Abtötung von CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary), denen CD47 und andere menschliche Rezeptoren fehlen. Dies bestätigte, dass die im Proliferationstest beobachtete Zytotoxizität vom monovalenten PKT16-Peptid selbst und nicht von TAMRA herrührte. Selbst wenn TAMRA einen Einfluss auf den Bindungs-assay gehabt hätte – was schwer zu bestimmen ist, da die meisten Chromophore zu unspezifischer Bindung beitragen können –, hatte es keinen Einfluss auf die unspezifische Bindung und Abtötung, die im Zellproliferations-assay beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu band die multivalente Dextran-PKT16-Verbindung zwar unspezifisch im Bindungs-assay (der mit TAMRA-Markierung durchgeführt wurde), induzierte jedoch keine vergleichbare Abtötung von CHO-Zellen im Proliferations-assay. Diese Beobachtungen deuten auf einen nicht rezeptorvermittelten Mechanismus für das monovalente PKT16-Peptid hin, möglicherweise aufgrund seiner Fähigkeit, an Zellmembranen zu binden und Stressreaktionen auszulösen, anstatt spezifisch auf CD47 abzuzielen. Zukünftige Arbeiten könnten die CD47-Selektivität wiederherstellen, indem die PKT16-Sequenz neu gestaltet wird – zurück zum nativen Thrombospondin-1-Motiv, um die Ursache der unspezifischen Bindung zu bestimmen – und die systemische Halbwertszeit optimiert wird, um die Freisetzung langlebiger, membranaktiver Fragmente zu verhindern. Angesichts der breiten Expression von CD47 muss die In-vivo-Verwendung jeder multivalenten Dextran-PKT16-Verbindung genau überwacht werden, um eine nicht rezeptorvermittelte Toxizität zu vermeiden. Das zweite Konjugat zielt auf das Fibroblasten-Aktivierungsprotein (FAP) ab, eine Membran protease, die in Krebs-assoziierten Fibroblasten stark exprimiert wird, in normalen adulten Geweben jedoch praktisch nicht vorkomm. Frühe Arbeiten konzentrierten sich auf FAPi 46, das jedoch durch oncoFAP ersetzt wurde, einen selektiveren und synthetisch leichter zugänglichen Inhibitor. Es wurde eine Reihe von Valenzen verwendet, um das mit Azid markierte oncoFAP an das alkin-funktionalisierte Dextran-Grundgerüst zu binden, gelegentlich wurde 5-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) eingebaut, um die Molekülverfolgbarkeit in vitro und in vivo zu gewährleisten. In Biodistributionsstudien an Mäusen reicherte sich das Konjugat in FAP-reichen Tumouren an und zeigte eine schnelle hepatobiliäre und renale. Die im Hirngewebe nachgewiesene Fluoreszenz zeigte, dass die Verbindung das Blut-Hirn-Schranke (BHS) passierte, was darauf hindeutet, dass die Plattform bei sorgfältiger Abstimmung der Valenz von oncoFAP und der Gesamtmolekülgröße potenziell kompakte Zytotoxine wie Monomethyl-Auristatin E (MMAE) zu Gliomen transportieren könnte, einer Krebsart, die gegenüber herkömmlichen Medikamenten weitgehend unempfindlich ist.

Als letztes Konjugat war ein Dextran-Konjugat mit dem Toll-like-Rezeptor-7/8-Agonisten (T785) vorgesehen, das eine lokale angeborene Immunantwort auslösen und gleichzeitig im Blutkreislauf inaktiv bleiben sollte. Ein Immunglobulin G1 auf dem Gerüst wurde an seiner fragment-kristallisierbaren (Fcγ) Domäne mit einem spaltbaren Linker maskiert. Im Blutkreislauf verhindert diese Maske die Bindung an den Fcγ-Rezeptor; in der protease reichen Mikroumgebung des Tumours wird sie entfernt, Makrophagen binden das freiliegende Fc, internalisieren das Konjugat und transportieren T785 zu den Endolysosomen, wo es an die Toll-like-Rezeptoren 7 und 8 bindet und die Freisetzung von Interleukin und Tumournekrosefaktor α (TNF α) auslöst. In makrophagen ähnlichen THP-1-Zellen war die maskierte Verbindung inert, während die unmaskierte Form einen starken TNF-α-Anstieg hervorrief, was bestätigt, dass die protease abhängige Gating-Funktion wie vorgesehen funktioniert. Geplante Studien werden zunächst die Internalisierungskinetik in Tumour-Makrophagen-Co-Kulturen quantifizieren. In Abhängigkeit von den toxikologischen Daten wird der nächste Schritt ein 30-tägiges Tumoursuppressionsexperiment in Xenotransplantat-Mausmodellen sein. Obwohl diese In-vivo-Tests nicht Gegenstand der vorliegenden Dissertation sind, erfüllt das T785-Dextran-Design bereits die wichtigste Anforderung: eine starke, auf den Tumour beschränkte Immunaktivierung mit minimaler systemischer Entzündung. Zusammen genommen bestätigen diese Ergebnisse, dass Dextran ein vielseitiges, orthogonal funktionalisiertes Gerüst ist, das verschiedene Nutzlasten transportieren kann und dabei seine biologische Aktivität beibehält. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Optimierung der Linker Stabilität, die Skalierung der GMP-Synthese und die Weiterentwicklung der vielversprechendsten Kandidaten zu formalen Toxikologie- und Wirksamkeitsstudien konzentrieren.