The immunogenic potential of carbon ions and the involved mechanisms in tumor cells

Triple-negative breast cancer and osteosarcoma are aggressive, highly metastatic, and radioresistant tumors that require innovative therapeutic approaches to improve clinical outcomes. Radiotherapy is a cornerstone of cancer treatment, used in nearly half of all cancer patients. The immunogenic signals elicited by X-ray exposure in cancer cells are relatively well-documented and form the basis for combined radiotherapy and immunotherapy approaches. Radiotherapy with charged particles, particularly carbon ions, hold promise for overcoming radioresistance due to the prevalence of direct DNA damage and the reduced dependency on oxygen, while at the same time sparing the healthy tissues to a higher extent. The impact of carbon ions on the immunogenicity of cancer cells is understudied but represents an important area of research for combinations of charged particle therapy with immunotherapy for radioresistant cancers in advanced stages. This work addresses the limited knowledge of the immunogenic potential of carbon ions analyzing immunogenic molecules and mechanisms activated in murine triple-negative breast cancer (4T1 cells) and osteosarcoma (LM8 cells). For most of the endpoints, different doses and time points were analyzed and the results of carbon ions were compared to X-rays. The results highlighted that carbon ion irradiation effectively overcomes the radioresistance of both cell lines. In LM8 cells with a functional p53 protein, carbon ions induce more effectively regulated cell death than X-rays. In contrast, in 4T1 cells with a non-functional p53, radiation predominantly triggers mitotic catastrophe, which can delay radiation-induced cell death (in the form of apoptosis, ferroptosis, or necroptosis). Irradiation of both cell lines with carbon ions also results in an enhanced or similar release of immunostimulatory molecules, such as cytokines and chemokines, compared to X-rays. In particular, the in vitro mechanisms underlying the higher efficiency of carbon ions compared to X-rays in reducing lung metastasis in an in vivo osteosarcoma model (Helm et al., 2021) were investigated. This work revealed a higher induction of adjuvant molecules after irradiation with carbon ions of osteosarcoma cells, in the form of damage-associated molecular patterns (DAMPs), cytokines, and chemokines compared to X-rays. Moreover, the occurrence of cytoplasmic dsDNA and the activation of the cGAS-STING pathway, which results in immunostimulatory interferon-β release, were analyzed in triple-negative breast cancer cells based on the results of Vanpouille-Box and colleagues (Vanpouille-Box et al., 2017). The results indicate that the occurrence of cytoplasmic dsDNA is correlated with the features of mitotic catastrophe observed in 4T1 cells and that carbon ions induce more efficiently cytoplasmic dsDNA and interferon-β release than X-rays. The influence of a fractionated irradiation scheme with X-rays was also investigated with respect to the cGAS-STING pathway and the release of interferon-β. The higher immunogenicity of a 3x8 Gy over a single high dose demonstrated by Vanpouille-Box and colleagues (Vanpouille-Box et al., 2017) could not be reproduced in this work. This points to other effects besides the immunogenic signals released by cancer cells (e.g. on the tumor microenvironment or adjacent tissues) that can additionally explain the advantages of fractionation observed in vivo (Vanpouille-Box et al., 2017). One of the factors inducing radioresistance is intratumoral hypoxia, which is present in some solid tumors including osteosarcoma. Carbon ions, having a more direct effect on the target molecule (DNA), have the potential to reduce radioresistance but the data on their immunogenicity in reduced oxygen concentrations are limited. Therefore, the interplay between hypoxia, the linear energy transfer of the particle, and immunogenic cell death was additionally investigated in this study. The results indicate that the enhanced immunogenic potential of carbon ions may be limited by reduced oxygen levels and that increasing the linear energy transfer may not trigger a higher level of immunogenic signals. Overall, this study integrates data on damage-associated molecular patterns, immune ligands, cytokines, and chemokine release, indicating a higher or similar immunogenicity of carbon ions compared to X-rays. These findings highlight that carbon ion radiotherapy is a powerful modality for potentially overcoming the limitations of conventional radiotherapy and its combination with immunotherapies can be an asset, particularly for the treatment of advanced and radioresistant tumors.

Triple-negativer Brustkrebs und Osteosarkom sind aggressive, hoch metastatische und strahlenresistente Tumoren, die innovative therapeutische Ansätze erfordern, um die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Die Strahlentherapie ist ein Eckpfeiler der Krebsbehandlung und wird bei fast der Hälfte aller Krebspatienten eingesetzt. Die durch Röntgenstrahlung ausgelösten immunogenen Signale in Krebszellen sind relativ gut dokumentiert und bilden die Grundlage für kombinierte Ansätze von Strahlentherapie und Immuntherapie. Die Strahlentherapie mit geladenen Teilchen, insbesondere Kohlenstoffionen, hat das Potenzial, die Radioresistenz zu überwinden, da sie direktere Schäden an der DNA verursacht und weniger von Sauerstoff abhängt, während sie gleichzeitig gesunde Gewebe besser schont. Die Auswirkungen von Kohlenstoffionen auf die Immunogenität von Krebszellen sind wenig untersucht, stellen jedoch ein wichtiges Forschungsfeld dar, insbesondere im Hinblick auf Kombinationen aus geladenen Teilchentherapien und Immuntherapien für strahlenresistente Tumoren im fortgeschrittenen Stadium. Diese Arbeit befasst sich mit dem immunogenen Potenzial von Kohlenstoffionen und analysiert immunogene Moleküle sowie Mechanismen, die in murinen dreifach-negativen Brustkrebszellen (4T1-Zellen) und Osteosarkomzellen (LM8-Zellen) Moleküle werden aktiviert. Für die meisten Endpunkte wurden verschiedene Dosen und Zeitpunkte analysiert, und die mit Kohlenstoffionen und mit Röntgenstrahlen erzielten Ergebnisse wurden verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bestrahlung mit Kohlenstoffionen die Strahlenresistenz beider Zelllinien wirksam überwindet. In LM8-Zellen mit funktionellem p53 induzieren Kohlenstoffionen effektiver regulierte Zelltod-Mechanismen als Röntgenstrahlen. Im Gegensatz dazu lösen beide Strahlungsarten in 4T1-Zellen mit nicht-funktionalem p53 vorwiegend eine mitotische Katastrophe aus, die den strahlungsinduzierten Zelltod (in Form von Apoptose, Ferroptose oder Nekroptose) verzögern kann. Die Exposition beider Zelllinien mit Kohlenstoffionen führt auch zu einer verstärkten oder ähnlichen Freisetzung immunstimulierender Moleküle wie Zytokinen und Chemokinen im Vergleich zu Röntgenstrahlen. Insbesondere wurden die in vitro zugrunde liegenden Mechanismen untersucht, die die höhere Effizienz von Kohlenstoffionen im Vergleich zu Röntgenstrahlen bei der Reduktion von Lungenmetastasen in einem in vivo Osteosarkom-Modell (Helm et al., 2021) erklären. Diese Arbeit zeigte eine höhere Induktion adjuvanter Moleküle durch Osteosarkomzellen in Form von schadenassoziierten molekularen Mustern, Zytokinen und Chemokinen. Darüber hinaus wurden in dreifach-negativen Brustkrebszellen das Vorhandensein von zytoplasmatischer doppelsträngiger DNA (dsDNA) und die Aktivierung des cGAS-STING-Signalwegs, der eine immunstimulierende Freisetzung von Interferon-β bewirkt, untersucht. Dies basiert auf den Ergebnissen von Vanpouille-Box und Kollegen (Vanpouille-Box et al., 2017). Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von zytoplasmatischer dsDNA mit den Merkmalen der mitotischen Katastrophe in 4T1-Zellen korreliert und dass Kohlenstoffionen eine höhere Fähigkeit haben, zytoplasmatische dsDNA und Interferon-β freizusetzen, als Röntgenstrahlen. Der Einfluss eines fraktionierten Bestrahlungsschemas mit Röntgenstrahlen wurde ebenfalls in Bezug auf den cGAS-STING-Signalweg und die Freisetzung von Interferon-β untersucht. Die von Vanpouille-Box und Kollegen (Vanpouille-Box et al., 2017) nachgewiesene höhere Immunogenität von 3x8 Gy gegenüber einer einzelnen hohen Dosis konnte in dieser Arbeit nicht reproduziert werden. Dies deutet auf andere Effekte hin, die neben den von Krebszellen freigesetzten immunogenen Signalen (z. B. im Tumormikroumfeld oder in angrenzendem Gewebe) die Vorteile der Fraktionierung in vivo zusätzlich erklären können (Vanpouille-Box et al., 2017). Zu den Faktoren, die Strahlenresistenz verursachen, zählt die intratumorale Hypoxie, die in einigen soliden Tumoren einschließlich Osteosarkomen vorkommt. Kohlenstoffionen, bei denen der direkte Effekt auf das Zielmolekül (DNA) überwiegt, haben das Potenzial, die Strahlenresistenz zu senken, aber die Daten zu ihrer Immunogenität bei reduziertem Sauerstoffgehalt sind begrenzt. Daher wurde in dieser Studie das Zusammenspiel von Hypoxie, der linearen Energieübertragung (LET) der Partikel und dem immunogenen Zelltod untersucht. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das erhöhte immunogene Potenzial von Kohlenstoffionen im Vergleich zu Röntgenstrahlen durch reduzierte Sauerstoffkonzentrationen eingeschränkt sein könnte und dass eine Erhöhung der linearen Energieübertragung nicht unbedingt zu einer Erhöhung der Immunogenität führt. Insgesamt integriert diese Arbeit Daten zu molekularen Mustern (DAMPs), die mit der Qualität und Quantität der DANN-Schäden assoziiert sind, immunogenen Liganden sowie der Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen, die auf eine mehr oder weniger ähnlich ausgeprägte Immunogenität von Kohlenstoffionen im Vergleich zu Röntgenstrahlen hinweisen, je nach analysiertem Molekül. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kohlenstoffionen-Strahlentherapie eine leistungsstarke Variante zur möglichen Überwindung der Grenzen konventioneller Strahlentherapie darstellt, und ihre Kombination mit Immuntherapien eine Verbesserung darstellen kann, insbesondere für die Behandlung fortgeschrittener und strahlenresistenter Tumoren, sein kann.