Generation of a class A/B hybrid G protein-coupled receptor system as a proximity-assisted screening tool for agonists and allosteric modulators

G protein-coupled receptors (GPCRs) are seven-transmembrane domain proteins, which are key regulators in a variety of signaling pathways transferring extracellular signals into a cellular response. Due to this reason, they are studied since decades as targets within the drug discovery field. Recent trends however indicate a narrowing of the pipeline within GPCR drug discovery. Furthermore, there is a need for new lead structures to address ongoing problems of ligand selectivity towards a target receptor or a signaling pathway. Primary screenings for the discovery of new chemical motifs as lead structures are highly dependent on the detection limit of the applied assay as this factor might lead to missing of low affinity ligands. Proximity-mediated methods can be a way to address this problem by recruiting the test ligand directly to the target and thereby increasing its local concentration. In this work a screening method based on a hybrid class A/B GPCR system for the identification of potential class A GPCR ligands was investigated. Towards this goal, a system with a hybrid receptor and a hybrid ligand was generated, enabling the tethering of the test ligand and inducing proximity to the desired target class A transmembrane domain (TMD). The work was divided into two main parts. Within the first part of this project hybrid GPCRs were generated by fusion of the class B1 GPCR corticotropin releasing factor receptor 1 (CRF₁R) extracellular domain (ECD) to the N-terminal end of the TMD of the class A model receptor neurotensin receptor 1 (NTR₁). Furthermore, hybrid ligands were synthesized by conjugation of NTR₁ ligands to a peptide binder of the CRF₁R-ECD. The recruitment of these hybrid ligands was tested for the neurotensin fragment NT ¹⁰⁻¹³, which was identified before as the shortest active sequence of the endogenous ligand neurotensin (NT). Conjugation to the ECD-anchor peptide increased the potency of this ligand by 20-fold resulting in a comparable activity as observed for NT. Subsequently an optimized parallel synthesis and screening procedure for the synthesis of peptide ligands was established and tested based on this short NTR₁ ligand. Purity analysis by sample testing revealed a good library quality, which allowed to use the hybrid test ligands directly in a cellular screening without additional purification. The crude screening towards CRF₁R-NTR₁ activation in a cellular assay led to the detection of some hybrid agonists, revealing new structure activity relationship (SAR) information for the tetrapeptide activation sequence of NT. The second part of this work focused on the expansion of the here described hybrid-GPCR system towards the screening for positive allosteric modulators (PAMs) of class A GPCRs. Using the example of a known PAM for the muscarinic acetylcholine receptor 2 (M₂R) the adaption of the hybrid GPCR method was tested towards the applicability for the screening of extracellular PAMs. The experiments revealed that the effect of potency enhancement caused by the hybrid approach could indeed be transferred for the investigation of allosteric modulators with a potency increase of >20 times for the investigated example ligands. For an expansion of the method to more targets eight additional class A GPCRs were used to generate functional hybrid class A/B receptors. Applying the established synthesis procedure a combinatorial hybrid peptide library of over 1300 peptides was synthesized and tested as crude in a PAM screening against seven of these hybrid GPCRs. Almost all screenings revealed a good assay quality and an acceptable rate of false positive signals. However, none of the initial PAM hits could be verified. The main reason for this might be the library size. Therefore, the last part of this work investigated the implementation of an one-bead-one-compound (OBOC) screening approach for the hybrid system. This preliminary work revealed encouraging results for the application of the OBOC-hybrid GPCR method for the high-throughput-screening of different GPCR ligands. My work thereby describes a new screening approach, which might be a useful tool in the ligand identification of low-affinity lead compounds for challenging GPCR targets. The described results further suggest a broad application of the hybrid method for different receptors and ligand types.

G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind Proteine bestehend aus sieben Transmembrandomänen, die als Schlüsselregulatoren an einer Vielzahl von Signalwegen beteiligt sind, indem sie extrazelluläre Signale in eine intrazelluläre Antwort übersetzen. Aus diesem Grund galten Proteine dieser Klasse seit Jahrzenten als interessante Ziele in der Wirkstoffforschung. Aktuelle Entwicklungen weisen jedoch auf einen Zurückgang der Arzneimittelentwicklung im Bereich der GPCRs hin. Des Weiteren besteht der Bedarf nach neuen Leitstrukturen zur Adressierung der Selektivitätsprobleme von GPCR-Liganden bezüglich eines speziellen Zielrezeptors oder eines spezifischen Signalwegs. Primäre Screenings zur Entdeckung neuer chemischer Motive als Leitstruktur sind hierbei stark vom Detektionslimit der jeweiligen Methode beeinflusst, da dieses zu einem Übersehen von niedrig affinen Liganden führen kann. Proximitäts-basierende Methoden können eine Möglichkeit zur Umgehung dieses Problems darstellen. Durch Rekrutierung des Testliganden zum Wirkstoffziel wird hierbei die lokale Konzentration des Liganden erhöht. In dieser Arbeit wurde eine Screeningmethode zur Identifizierung potentieller Klasse A GPCR Liganden basierend auf einem hybriden Klasse A/B GPCR System untersucht. Hierzu wurde ein System bestehend aus hybridem Rezeptor und hybriden Liganden entwickelt, welches eine gezielte Rekrutierung des Testligaden ermöglicht. Letztere induziert die Nähe zu der Transmembrandomäne (TMD) des Klasse A Zielrezeptors. Dabei wurde das hier dargestellte Projekt in zwei Hauptteile eingeteilt. Im ersten Teil der Arbeit wurden hybride GPCRs hergestellt, indem die extrazelluläre Domäne (ECD) des Klasse B1 GPCRs Corticotropin-freisetzender Faktor Rezeptor 1 (CRF₁R) an das N-terminale Ende der TMD des Klasse A Modelrezeptors Neurotensinrezeptor 1 (NTR₁) fusioniert wurde. Zudem wurden hybride Liganden durch Konjugation von NTR₁ Liganden an ein CRF₁R-ECD bindendes Peptid hergestellt. Die Rekrutierung von weniger affinen Liganden zum hybriden GPCR wurde anhand des Neurotensinfragments NT¹⁰⁻¹³ getestet, welches als kleinste noch aktive Sequenz des endogenen Liganden Neurotensin (NT) identifiziert wurde. Die Konjugation dieses Liganden an das ECD-Ankerpeptid führte zu einer Wirksamkeitssteigerung von >20-fach und resultierte in einer zu NT vergleichbaren Effizienz. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein optimierter Synthese- und Screening-Prozess zur parallelen Synthese von Peptidliganden entwickelt und validiert. Eine Stichprobenanalyse der generierten Liganden bestätigte eine gute Qualität der Substanzbibliothek, welche eine direkte Verwendung der Liganden im zellulären Screening ohne vorherige Reinigung ermöglichte. Das Screening auf Aktivierung des hybriden Rezeptors CRF₁R-NTR₁ in einem zellulären Test führte zur Detektion einiger hybrider Agonisten, welche neue Struktur-Aktivitäts-Beziehungs-Informationen zu der Tetrapeptid Aktivierungssequenz von NT lieferten. Der zweite Teil dieser Arbeit fokussiert sich auf die Expansion der hier beschriebenen Methode auf das Screening von allosterischen Modulatoren für weiter Klasse A GPCRs. Anhand des Beispiels eines bekannten positiven allosterischen Modulators (PAM) des Muskarinischen Acetylcholinrezeptors (M₂R) wurde die Adaption des Verfahrens zur Detektion von extrazellulären allosterischen Modulatoren untersucht. Die Experimente zeigten, mit einer >20-fachen Wirksamkeitssteigerung der untersuchten Ligaden, dass der Proximitäts-Effekt verursacht durch das hybride-System tatsächlich auf die Untersuchung von allosterischen Modulatoren übertragbar ist. Zur Erweiterung der Methode auf weitere Zielrezeptoren wurden hybride GPCR-Konstrukte für acht zusätzliche Klasse A GPCRs hergestellt. Durch Anwendung des etablierten Syntheseprotokolls wurde eine kombinatorische hybride Peptidbibliothek von mehr als 1300 Peptiden synthetisiert und in Screenings für positive allosterische Modulatoren (PAMs) für sieben der hydriden GPCRs getestet. Die Mehrheit der Screening-Experimente wies eine gute Assayqualität und eine akzeptable Rate an falsch positiven Hits auf. Jedoch konnte keiner der initialen PAM-Hits verifiziert werden. Da der Hauptgrund für dieses Ergebnis auf die Bibliotheksgröße zurückgeführt wurde, befasste sich der letzte Teil der Arbeit mit der Implementierung eines „Ein-Partikel-eine-Verbindung“ (one bead one compound, OBOC) -Screening Ansatzes für das hybride GPCR-System. Diese einleitenden Arbeiten zeigten vielversprechende Ergebnisse für die Anwendung einer OBOC-hybrid-GPCR-Methode für das Hochdurchsatz-Screening von unterschiedlichen GPCR-Liganden auf. Somit beschreibt meine Arbeit einen neuen Screening-Ansatz, welcher als nützliches Werkzeug in der Identifikation von niedrig-affinen Leitstrukturen für herausfordernde GPCRs verwendet werden kann. Die dargestellten Ergebnisse weisen zu dem auf eine breitere Anwendung der hybriden Methode für weitere Rezeptoren und Ligandentypen hin.