Development and engineering of RNA aptamers for riboswitching and biosensing

RNAs can form highly complex three-dimensional structures that allow them to bind target molecules with high affinity and specificity. These so-called RNA aptamers are not only found in nature but can also be selected in vitro using a method called SELEX. In theory, this method allows the selection of aptamers for any target, such as small molecules, proteins and even cells. For this selection process, a target is immobilized and incubated with a randomized pool of RNA sequences. During a washing step, only those sequences remain that bound to the target, while non-binding ones are removed. The bound RNA sequences are then recovered, amplified, and used for additional cycles. This process is repeated until the original RNA pool is enriched with binding sequences. The presented work employs a relatively novel variation of the SELEX protocol called RNA Capture-SELEX. In this method, the randomized pool of RNA sequences is immobilized and not the target of the selection. This is achieved via a capture oligonucleotide that binds a constant sequence located within the randomized part of each sequence in the pool. This offers two key advantages over the traditional protocol. Firstly, the target of the selection remains in solution and is not chemically immobilized. Especially the structure of smaller molecules can be drastically changed through such a chemical immobilization, which can lead to less successful and unspecific enrichments. Secondly, to be released from the capture oligonucleotide, the aptamer must undergo a structural change upon target binding. This means that RNA Capture-SELEX innately selects RNA aptamers that change stability and structure depending on the presence or absence of a ligand. This structural change can be exploited for the design and selection of synthetic RNA constructs such as riboswitches, ribozymes, and biosensors. The first part of this work consists of the characterization and engineering of a new, tobramycin binding riboswitch. It is one of the best performing constructs in its class of translation initiation controlling riboswitches and even rivals the tetracycline riboswitch. The riboswitch sequence that was initially selected contained two independent tobramycin binding sites with Kds of 1.1 nM and 2.4 μM and it is capable of differentiating tobramycin from the closely related substances kanamycin A and B. With mutational analysis, ITC and 1H NMR spectroscopy the secondary structure of the riboswitch could be established, and it was found that the two binding sites are located in different parts of the structure. The two binding sites were turned into separate constructs and separately analyzed. The high affinity binding site with a Kd of 1.1 nM was solely responsible for the observed regulation and engineered into a minimal riboswitch sequence with a size of only 33 nt and good performance. The second part of this work comprised of the selection and characterization of a caffeine binding RNA aptamer and its use in a riboswitch, aptazyme and biosensor. After in vitro selection and in vivo yeast screening, the riboswitch was systematically shortened. In a doped pool screening approach, the riboswitch was partially randomized, but it was found that the originally selected sequence was already close to optimal. The caffeine binding aptamer was then used for the engineering of a hammerhead ribozyme based aptazyme. The aptazyme achieved a 2x gene regulation when placed in a 3’ UTR in yeast. The aptamer was then grafted onto an iSpinach fluorogenic aptamer and thereby turned into a fluorescence-based biosensor that could detect caffeine above a concentration of 100 µM. The third part of this work focused on a proof-of-concept for a modular, aptamer-based lateral flow assay. For this, a levofloxacin binding aptamer, that was also selected using RNA Capture-SELEX, was used as a bioreceptor. The biosensor made use of the principle that aptamers selected with RNA Capture-SELEX displace a DNA capture oligonucleotide when binding a ligand. The lateral flow assay specifically detected levofloxacin and could distinguish it from the closely related compound ciprofloxacin. With a limit of visual detection of 100 µM sample concentration, the assay is not sensitive enough for a direct use in environmental testing. However, the presented assay establishes a proof-of-concept for the development of biosensors based on RNA Capture-SELEX selected aptamers.

RNA kann hochkomplexe, dreidimensionale Strukturen ausbilden, die es ihr erlaubt, Moleküle mit hoher Affinität und Spezifität zu binden. Solche sogenannten RNA-Aptamere finden sich nicht nur in der Natur, sondern können auch in vitro mittels der SELEX-Methode selektiert werden. Diese Methode erlaubt es prinzipiell, Aptamere für jeden möglichen Bindungspartner, wie kleine Moleküle, Proteine und ganze Zellen, zu selektieren. Für diese Art der Selektion wird das gewünschte Zielmolekül immobilisiert und mit einem Pool randomisierter RNA-Sequenzen inkubiert. In einem Waschschritt verbleiben nur die Sequenzen, die an das Zielmolekül binden. Alle nicht-bindenden Sequenzen werden durch diesen Schritt entfernt. Die gebundenen Sequenzen werden dann aufgefangen, amplifiziert und für weitere SELEX-Runden verwendet. Dieser Prozess wird so lange wiederholt, bis sich in dem Pool Sequenzen angereichert haben, die das Zielmolekül binden. Für die hier präsentierte Arbeit wurde eine neue Version des SELEX-Protokolls mit dem Namen RNA-Capture-SELEX verwendet. Bei dieser Methode wird der randomisierte RNA-Pool und nicht das Zielmolekül der Selektion immobilisiert. Dies wird mit einem Capture-Oligonukleotid erreicht, das eine konstante Sequenz innerhalb der randomisierten Pool-Sequenz bindet. Dies bietet zwei wesentliche Vorteile gegenüber dem klassischen Protokoll. Erstens wird das Zielmolekül nicht chemisch immobilisiert, sondern verbleibt in Lösung. Besonders die Struktur von kleinen Molekülen kann durch eine chemische Immobilisierung stark verändert werden, was zu weniger erfolgreichen und unspezifischen Anreicherungen führen kann. Zweitens muss das Aptamer bei Bindung eine strukturelle Änderung durchführen, um sich vom Capture-Oligonukleotid zu lösen. Das bedeutet, dass RNA-Capture-SELEX speziell RNA-Aptamere selektiert, deren Stabilität und Struktur sich durch An- und Abwesenheit eines Liganden ändern. Diese Änderung der Struktur kann genutzt werden, um synthetische RNA-Konstrukte wie Riboswitche, Ribozyme und Biosensoren zu konstruieren. Der erste Teil dieser Arbeit besteht aus der Charakterisierung und dem Engineering eines neuen Tobramycin-bindenden Riboswitches. Dieser ist einer der besten in seiner Klasse der Translationsinitiation-kontrollierenden Riboswitche und konkurriert sogar mit dem Tetrazyklin-Riboswitch. Die ursprünglich selektierte Riboswitchsequenz beinhaltete zwei unabhängige Bindestellen für Tobramycin mit Kds von 1.1 nM und 2.4 μM und konnte Tobramycin von den beiden eng verwandten Substanzen Kanamycin A und B unterscheiden. Mit Hilfe von Mutationsanalysen, ITC und 1H NMR-Spektroskopie konnte die Sekundärstruktur des Riboswitches identifiziert werden. Hierbei konnten zwei distinkte Bindestellen an unterschiedlichen Stellen der Riboswitchstruktur lokalisiert werden. Aus den beiden Bindestellen wurden einzelne Konstrukte erstellt und separat untersucht. Die hochaffine Bindestelle mit einem Kd von 1.1 nM war allein verantwortlich für das beobachtete Schaltverhalten. Aus ihr konnte eine minimale Riboswitchsequenz mit einer Größe von nur 33 nt und sehr gutem Schaltverhalten konstruiert werden. Der zweite Teil dieser Arbeit bestand aus der Selektion und Charakterisierung eines Koffein-bindenden RNA-Aptamers und dessen Verwendung als Riboswitch, Aptazym und Biosensor. Nach in vitro Selektion und in vivo Hefescreening wurde der Riboswitch systematisch verkürzt. In einem ‚doped pool‘ Ansatz wurde der Riboswitch teilrandomisiert. Es zeigte sich aber, dass die Riboswitchsequenz nahezu optimal war. Als nächstes wurde das Koffeinaptamer für die Konstruktion eines Aptazyms verwendet, das auf dem Hammerhead-Ribozym basiert. Dieses Aptazym erreichte eine zweifache Genregulation, nachdem es in einen 3‘ UTR eines Reportergens in Hefe insertiert wurde. Das Aptamer wurde dann auf ein fluorogenes iSpinach-Aptamer gesetzt und so ein Fluoreszenz-basierter Biosensor konstruiert. Dieser Biosensor war in der Lage, Koffein ab einer Konzentration von 100 µM nachzuweisen. Der dritte Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf ein ‚proof-of-concept‘ für einen modularen, Aptamer-basierten ‚Lateral Flow Assay‘. Hierfür wurde ein Levofloxacin-bindendes Aptamer als Biorezeptor verwendet, das ebenfalls mittels RNA-Capture-SELX selektiert wurde. Dieser Biosensor nutzte das Prinzip, dass Aptamere, die mittels RNA-Capture-SELEX selektiert wurden, ein Capture-Oligonukleotide verdrängen können, wenn sie ihren Liganden binden. Das ‚Lateral Flow Assay‘ konnte spezifisch Levofloxacin detektieren und es vom eng verwandten Stoff Ciprofloxacin unterscheiden. Mit einem visuellen Detektionslimit von 100 µM Analytkonzentration ist der Assay nicht sensitiv genug für die direkte Verwendung in Umwelttests. Dennoch demonstriert der Assay ein ‚Proof of Concept‘ für die Entwicklung von Biosensoren auf Basis von Aptameren, die über RNA-Capture-SELEX gefunden wurden.