Erschließung einer natürlichen Peptid-Protein-Wechselwirkung als molekulare Grundstruktur zur hochaffinen Kopplung von Proteinen und Entwicklung biotechnologischer Anwendungsmodule

Die Steuerung fast aller Vorgänge in biologischen Organismen beruht auf Molekülerkennung. Der weit überwiegende Teil diagnostischer und pharmazeutischer Lösungen basiert auf spezifischen molekularen Wechselwirkungen. Protein-Protein-Interaktionen spielen dabei eine wesentliche Rolle. Um daraus einen Nutzen zu ziehen kommt es darauf an, sich der ausprägenden Strukturmotive der Wechselwirkung innerhalb einer Aminosäuresequenzen in geeigneter Weise zu bedienen. Die in den letzten Jahrzehnten etablierten molekularbiologischen Methoden ermöglichen es, derartige Erkennungsmuster für verschiedene biotechnologische Konzepte nutzbar zu machen. So können Proteine, die Gegenstand aktueller biologischer oder biomedizinischer Forschung sind, mit Sequenzbereichen eines interagierenden Proteins fusioniert werden. Mit Hilfe ihres komplementären Interaktionspartners ist es möglich sie zu identifizieren und aus komplexen Stoffgemischen zu isolieren oder ihre Stoffwechselwege zu verfolgen und somit biologische Prozesse zu charakterisieren. Im Idealfall verleihen diese Anhängsel oder Tags dem Fusionsprotein zusätzlich bestimmte Eigenschaften und sind flexibel in verschiedenen Methoden einsetzbar. Die vorliegende Arbeit bedient sich zweier Komponenten des bakteriellen Typ IV Sekretionssystems, ein Konjugationsapparat dessen Proteinkomplex die bakterielle Membran durchspannt und biologische Makromoleküle transportiert. Das TraO-Protein dieses Komplexes weist eine ausgesprochen starke Interaktion gegenüber dem TraN-Peptid auf, wodurch TraO in der äußeren Membran der Zelle verankert wird. Die Interaktionspartner wurden für unterschiedliche Applikationen optimiert und die Wechselwirkungen verschiedener Derivate charakterisiert. Seitens TraO wurden Sequenzmodifikationen zur Verbesserung der biochemischen Eigenschaften vorgenommen. Bei TraN erfolgten eine sukzessive Verkürzung sowie punktuelle Austausche innerhalb der Aminosäuresequenz, um das für die Bindung benötigte Minimalmotiv zu identifizieren und die Sequenz für verschiedene Anwendungen nutzbar zu machen. Letztendlich konnten mehrere Varianten des TraO/TraN-Systems identifiziert werden, die sich zur weiteren Entwicklung biotechnologischer oder biochemischer Applikationen anbieten. Das entwickelte System konnte erfolgreich in der affinitätschromatographischen Reinigung von biologisch aktiven Zytokinen eingesetzt werden und ist im Western Blot detektierbar. Mit TraN markierte Proteine konnten auf eukaryontischen Zellen exprimiert und nachgewiesen werden. Die zielgerichtete Fluoreszenzmarkierung von Rezeptorproteinen mit Hilfe des TraO/TraN-Systems machte es darüber hinaus möglich, geeignete Sonden herzustellen um Zytokin-Rezeptorinteraktionen auf Oberflächen nachzuweisen. Durch weitere Modifikationen der Bindungspartner konnte eine kovalente Bindung zwischen Protein und Peptid hergestellt werden. Für die unterschiedlichen Applikationen konnten diverse Varianten des Tag-System etabliert werden. Die beschriebenen Ergebnisse zeigen das große Potenzial des TraO/TraN-Systems für die biotechnologische Verwendung auf.

The control of almost every event in biological organisms is dependent on molecular recognition. The vast majority of diagnostic and pharmaceutic applications are based on the deployment of molecular interactions. Thereby protein-protein-interactions play a crucial role. Hence, it comes down to make a use of the amino acid sequence motifs that mark the associates of biological reactions. The molecular biologic methods established over the past decades are used to utilize such recognition sites for biotechnological concepts. Proteins which are subject to current biological or biotechnological research can be fused to sequencees of interacting proteins. With its complementary the identification and isolation from a complex composure of substances can be achieved or its metabolic pathways can be tracked and biological processes characterized. Ideally these labels or tags are customizable for diverse applications and provide additional properties to the target protein and can be used flexibly in diverse methods. The present work employs two components of the bacterial type IV secretion system, a conjugation device made of a protein complex, which is spanning the bacterial envelope and is responsible for the transportation of biological molecules. The TraO-protein of this complex shows a very strong interaction towards the TraN-peptide, anchoring TraO in the outer membrane of the cell. The two interacting partners where optimized for different applications and the interaction of the derivates was characterized. The TraO-sequence was modified to improve its biochemical proporties. TraN was gradually shortened and selectively modified to identify the minimum motif for binding and to utilize the sequence for various applications. Eventually several variants of the TraO/TraN-system were identified for further deployment in biotechnological and biochemical applications. The developed system was successfully used for the purification of biologically active cytokines by affinity chromatography and is also detectable in western blot. TraN-labeled proteins were expressed and verified on eukaryotic cells. Moreover, the production of suitable probes by purposeful fluorescent labeling of receptor proteins with the TraO/TraN-system proofed cytokine-receptor-interactions on surfaces. By further modifications of the interacting partners a covalent binding between the TraO and TraN was established. The results of this work show the great potential of the TraO/TraN-system for biotechnological applications.