Die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nach Exposition niedriger Dosen Röntgenstrahlung

Niedrige Dosen ionisierender Strahlung im Bereich von wenigen mGy bzw. mSv sind im Leben eines jeden Menschen allgegenwärtig. Im Schnitt ist ein Mensch in Deutschland jährlich einer Dosis von etwa 4 mSv ausgesetzt, welche sich aus der natürlichen Strahlenexposition, z.B. durch das Vorkommen von Radionukliden in Böden oder manchen Lebensmitteln, und der Strahlenexposition durch u.a. CT-Aufnahmen im Rahmen von medizinischen Untersuchungen oder anderen technischen Anwendungen von ionisierender Strahlung zusammensetzt. Selbst solche niedrigen Dosen können die Zelle schädigen. Dabei sind insbesondere DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) kritisch, da sie die genetische Integrität der Zellen gefährden können, was die Entstehung von Krebs begünstigen kann. Zellen haben daher eine Vielzahl an Mechanismen entwickelt, um auftretende DSBs zu reparieren. Dennoch werden DSBs, die durch niedrige, alltäglich relevante Dosen ionisierender Strahlung verursacht werden, in normalen humanen Fibroblasten überraschenderweise nur ineffizient repariert. Im Gegensatz dazu werden DSBs, die durch hohe Strahlendosen verursacht werden, deutlich effizienter repariert. Wie die Zellen dosisabhängig die Reparatur von DSBs regulieren, ist bislang kaum bekannt und Gegenstand der Untersuchungen dieser Arbeit.

Um die ineffiziente Reparatur nach niedrigen Dosen und den zugrundeliegenden Mechanismus zu charakterisieren, wurde in dieser Arbeit zunächst in experimentellen Studien in kultivierten, humanen Fibroblasten und Epithelzellen bestätigt, was aus früheren Untersuchungen mit Fibroblasten (Rothkamm & Löbrich, 2003 und Grudzenski et al., 2010) bekannt war. So wurde in dieser Arbeit erneut gezeigt, dass Zellen in der G0/G1-Phase entstandene DSBs nach einer Bestrahlung mit hohen Dosen Röntgenstrahlung (z.B. 1 Gy) effizient reparieren, während sie DSBs nach Bestrahlung mit niedrigen Dosen (z.B. 10 mGy) ineffizient reparieren, sodass selbst nach 24 h Reparaturzeit die meisten DSBs unrepariert verbleiben. Werden die Zellen zusätzlich zur Bestrahlung mit niedrigen Dosen mit geringen Mengen Wasserstoffperoxid behandelt, kann die Reparatureffizienz deutlich gesteigert werden. Das Wasserstoffperoxid erzeugt in der verwendeten Konzentration Radikale in der Zelle, ohne selbst DSBs zu verursachen. Darauf aufbauende neue Untersuchungen mit einer molekularen Sonde, deren Fluoreszenzintensität vom Radikallevel der Zelle abhängt, bestätigen, dass bei niedrigen Dosen Röntgenstrahlen tatsächlich kaum Radikale entstehen, während bei hohen Dosen bzw. der Kombination aus Wasserstoffperoxid-Behandlung und Bestrahlung mit niedrigen Dosen vergleichbare, deutlich höhere Radikallevel entstehen. Dieser Unterschied im Radikallevel könnte den Unterschied der Reparatureffizienz bei verschiedenen Dosen erklären. Die Relevanz von intrazellulären Radikalen bei der Regulation der DSB-Reparatureffizienz wurde in vergleichenden Studien der DSB-Reparatureffizienz nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen sowie Anwendung des Radiomimetikums Neocarzinostatin (NCS) bestätigt, das im Gegensatz zur Strahlung weniger und räumlich begrenzt Radikale generiert. DSBs, die durch NCS erzeugt wurden, wurden etwas schlechter repariert als DSBs, die durch eine vergleichbare Strahlendosis erzeugt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass es ein kritisches Level von intrazellulären Radikalen gibt, welche für die Aktivierung der DSB-Reparatur nötig ist, was eine effiziente Reparatur der Brüche erlaubt.

Darauf aufbauend stellte sich die zentrale Frage dieser Arbeit, welche der involvierten DSB-Reparaturproteine radikalabhängig reguliert werden. Die DNA-abhängige Proteinkinase - catalytic subunit (DNA-PKcs) wurde als möglicher Kandidat identifiziert. Zum einen spielt DNA-PKcs eine zentrale Rolle in der DSB-Reparatur in Zellen der G0/G1-Phase, spezifisch im DSB-Reparaturweg Non-homologous end joining (NHEJ), sodass es plausibel erscheint, dass ein inaktives NHEJ für eine eingeschränkte DSB-Reparatur verantwortlich ist. Tatsächlich gab es im Rahmen dieser Arbeit experimentelle Hinweise darauf, dass NHEJ nach niedrigen Strahlendosen nicht aktiv sein könnte, aber durch Wasserstoffperoxid stimuliert wird. Zum anderen ist für die mit DNA-PKcs eng verwandte Kinase Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) eine radikalvermittelte Aktivierung beschrieben (Guo et al., 2010). Um zu analysieren, wie hoch die jeweilige Aktivität von DNA-PKcs und ATM bei verschiedenen Strahlendosen ist, wurde ihre Fähigkeit, die Histonvariante H2AX schadensspezifisch zu phosphorylieren, ausgenutzt. So wurde gezeigt, dass DNA-PKcs durch eine niedrige Strahlendosis – im Gegensatz zu einer hohen Dosis – nicht aktiviert wird, ATM dagegen dosisunabhängig aktiviert wird. Damit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen radikalvermittelten Aktivierungsweg von DNA-PKcs, der bei niedrigen Radikalleveln nicht ausreichend stimuliert wird.

Daraufhin wurde die radikalvermittelte Aktivierung von DNA-PKcs näher untersucht. Es wurde die Hypothese untersucht, dass die Aktivität von DNA-PKcs durch Proteine gesteuert wird, die wiederum selbst auf das zelluläre Radikallevel reagieren. Peroxiredoxine wurden in den letzten Jahren als redoxabhängige Regulatoren der zellulären Schadensantwort beschrieben und wurden daher auch in dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Rolle in der DSB-Reparatur untersucht. Durch den Inhibitor Adenanthin, welcher thiolhaltige Proteine und hier insbesondere die Peroxiredoxine PRDX2 und PRDX1 inhibiert, sowie durch die Depletion von PRDX2 und PRDX1 mittels siRNA, wird die Reparatureffizienz und DNA-PKcs-Aktivität bei niedrigen Dosen gesteigert, ohne dass das Radikallevel erhöht wird. Dies deutet auf eine kritische Rolle von Peroxiredoxinen in der Regulation der DNA-PKcs-Aktivität und damit der DSB-Reparatureffizienz hin. Co-Immunopräzipitationsstudien mit Flag-getaggtem PRDX2 in HEK293T-Zellen legen nahe, dass DNA-PKcs und PRDX2 bzw. möglicherweise auch andere Peroxiredoxine, wie PRDX1, bei niedrigen Dosen miteinander interagieren, bei höheren Dosen bzw. Radikalleveln dagegen nicht. Somit konnten in dieser Arbeit erste Hinweise erlangt werden, dass es eine radikalabhängige Interaktion zwischen PRDX2 bzw. PRDX1 und dem NHEJ-Faktor DNA-PKcs gibt. Diese Ergebnisse geben Anlass zur Vermutung, dass durch diese Interaktion die Aktivität von DNA-PKcs bei niedrigen Dosen gehemmt wird, was für die verminderte DNA-PKcs-Aktivität und die ineffiziente Reparatur nach niedrigen Dosen mitverantwortlich ist.

Diese Arbeit trägt dazu bei, die ablaufenden zellulären Prozesse nach einer Exposition mit niedrigen, alltäglichen Strahlendosen mechanistisch besser zu charakterisieren. So konnte einerseits eine neuartige radikalabhängige Aktivierung von DNA-PKcs, sowie andererseits die Rolle der Peroxiredoxine in der DSB-Reparatur nach niedrigen Strahlendosen identifiziert werden. Dies hilft beim Verständnis, wie in Zellen radikal- bzw. dosisabhängig die Effizienz von DSB-Reparaturprozessen gesteuert werden. Diese Erkenntnisse zu den molekularen Mechanismen, die nach der Exposition mit niedrigen, alltäglichen Strahlendosen ablaufen, können langfristig helfen, die Wirkung und assoziieren Risiken solcher Expositionen zukünftig besser abschätzen zu können.

Low doses of ionizing radiation in the range of a few mGy or mSv are omnipresent in every human's life. On average, a person in Germany is exposed to a dose of around 4 mSv per year, which is made up of natural radiation exposure, e.g. due to the presence of radionuclides in soil or some foods, and radiation exposure in the context of medical examinations, such as X-ray examinations or CT scans, or other technical applications of ionizing radiation. Even such low doses can damage the cell. DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly critical, as they can threaten the genetic integrity of cells, which can lead to the development of cancer. Cells have therefore developed a variety of mechanisms to repair occurring DSBs. Surprisingly, however, DSBs induced by low, everyday doses of ionizing radiation are only inefficiently repaired in normal human fibroblasts. In contrast, DSBs induced by high doses of radiation are repaired much more efficiently. How the cells regulate the repair of DSBs in a dose-dependent manner is still poorly understood and is the subject of this thesis.

To characterize the inefficient repair after low doses and the underlying mechanism, this work confirmed in experimental studies in cultured human fibroblasts and epithelial cells what was known from previous studies with fibroblasts (Rothkamm & Löbrich, 2003 and Grudzenski et al., 2010). In this work, it was again shown that cells in the G0/G1 phase efficiently repair DSBs formed after irradiation with high doses of X-rays (e.g. 1 Gy), while they inefficiently repair DSBs after irradiation with low doses (e.g. 10 mGy), so that even after 24 h repair time, most DSBs remain unrepaired. If the cells are treated with small amounts of hydrogen peroxide in addition to irradiation with low doses, the repair efficiency can be increased significantly. At the concentration used, hydrogen peroxide generates radicals in the cell without causing DSBs itself. Studies in the context of this work using a molecular probe, whose fluorescence intensity depends on the radical level of the cell, confirm that low doses of X-rays indeed produce hardly any radicals, while high doses or the combination of hydrogen peroxide treatment and irradiation with low doses produce significantly higher radical levels. This difference in radical level could explain the difference in repair efficiency at different doses. The relevance of intracellular radicals in the regulation of DSB repair efficiency was confirmed in comparative studies of DSB repair efficiency after irradiation with X-rays and treatment with the radiomimetic drug Neocarzinostatin (NCS), which, in contrast to radiation, generates fewer and spatially limited radicals. DSBs generated by NCS were repaired slightly worse than DSBs generated by a comparable dose of radiation. These results indicate that there is a critical level of intracellular radicals required to activate DSB repair and allow efficient repair of breaks.

Based on this, the central question of this work was which of the DSB repair proteins involved are regulated in a radical-dependent manner. The DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) was identified as a possible candidate. On the one hand, DNA-PKcs plays a central role in DSB repair in G0/G1 phase cells, specifically in the DSB repair pathway non-homologous end joining (NHEJ), so it seems plausible that an ineffective NHEJ is responsible for impaired DSB repair. In fact, there were experimental indications in the course of this work that NHEJ may not be active after low doses of radiation and is only stimulated by hydrogen peroxide. On the other hand, radical-mediated activation has already been described for the kinase Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM), which is closely related to DNA-PKcs (Guo et al., 2010). To analyze the respective activity of DNA-PKcs and ATM is at different radiation doses, their ability to phosphorylate the histone variant H2AX in a damage-specific manner was exploited. It was shown that DNA-PKcs is not activated by a low dose of radiation - in contrast to a high dose - while ATM is activated independently of the dose. This work thus provides the first evidence of a radical-mediated activation pathway of DNA-PKcs that is not sufficiently stimulated at low radical levels.

The mechanism of the radical-mediated activation of DNA-PKcs was then investigated in more detail. It was hypothesized that the activity of DNA-PKcs is controlled by proteins that react to the cellular radical level. In recent years, peroxiredoxins have been described as redox-dependent regulators of the cellular damage response and were therefore investigated in this work with regard to their role in DSB repair. The inhibitor Adenanthin, which inhibits thiol-containing proteins – in particular, the peroxiredoxins PRDX2 and PRDX1 – and the depletion of PRDX2 and PRDX1 by siRNA increase the repair efficiency and DNA-PKcs activity at low doses without increasing the radical level. This indicates a critical role of peroxiredoxins in the regulation of DNA-PKcs activity and thus DSB repair efficiency. Co-immunoprecipitation studies with Flag-tagged PRDX2 in HEK293T cells suggest that DNA-PKcs and PRDX2 or possibly also other representatives of the peroxiredoxins, such as PRDX1, interact with each other at low doses, but not at higher doses or radical levels. Thus, first insights could be obtained that there is a radical-dependent interaction between PRDX2 or PRDX1 and the NHEJ factor DNA-PKcs. These results give rise to the assumption that this interaction inhibits the activity of DNA-PKcs at low doses, which is partly responsible for the reduced DNA-PKcs activity and the inefficient repair after low doses.

This work contributes to a better mechanistic characterization of the cellular processes that occur after exposure to low, everyday radiation doses. On the one hand, a novel radical-dependent activation of DNA-PKcs and, on the other hand, the role of peroxiredoxins in DSB repair after low doses of radiation could be identified. This helps to understand how the efficiency of DSB repair processes is mediated in cells in a radiation- and dose-dependent manner. These findings on the molecular mechanisms that occur after exposure to low, everyday doses of radiation may help to better assess the effects and associated risks of such exposures in the future.