Time-Resolved Cryo-Correlative Light and Electron Microscopy of cells and microorganisms

Workflows of cryofixation and correlative imaging with light and electron microscopy are a key element for understanding structural biological questions. In addition to the high structural resolutions achieved, the question of allowing for temporally highly resolved images is becoming more relevant. In this thesis, a cryofixation method allowing temporal resolution is developed. Furthermore, it is shown for the first time, how it integrates into existing workflows and allows for imaging correlatively with novel as well as more established microscopy methods at cryogenic temperatures.

The cryofixation system used is based on the system developed by Fuest et al. [1]. The system has been modified to facilitate high cooling and thawing rates through the utilization of innovative heater materials. The system’s imaging capabilities are extended to multiple magnifications, robustness is ensured, and sample extraction is enabled. This is crucial for correlative imaging with cryo-immersion light microscopy (cryo-iLM) and cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) with focused ion-beam milling (FIB). In its core, the system contains a thin microfluidic channel containing the biological sample, which is placed onto a thin-film heater on a heatsink. While the heater is controlled to keep the sample at physiological temperatures, the heatsink is cooled down, close to liquid nitrogen temperatures. Then, turning the heater on and off, rapid cryofixation and thawing of the sample is enabled. The estimated cooling rates achieved are in the range of ~2-3 · 10000 K/s. The thawing rates are ~1 · 10000 K/s.

The system captures samples in a unique way, via the microfluidic component. This is demonstrated once by squeezing red blood cells (RBC) through elongated tapered microchannels to capture their deformation. It is furthermore shown that the red blood cells membrane structure is kept intact and cilia of Chlamydomonas reinhardtii (CC-6012) could be preserved even without the use of cryoprotectants. Furthermore, CC-125 cells are used to test the survival of cells to rapid freezing and thawing. With the current setup and rates these cells do not survive. Correlative imaging to cryo-iLM is demonstrated for the first time on RBCs as well as CC-6012 samples.

Once removed from the cryofixation system, the samples are transferred for further correlative imaging. First, the cells are imaged by cryo-iLM. For performing immersion microscopy at low temperatures, without devitrification, it is essential to select a matching immersion medium. Since measurements of refractive index (RI) at these low temperatures are difficult and uncommon, a method using asymmetrical optical gratings to measure the RI of a few select media is devised. The gratings are created with selective etching of two different metal layers as well as with greyscale lithography. The refractive index of HFE7200, HFE7100, and isopentane as well as a few mixtures are measured down to -140 °C. For later imaging with cryo-iLM, HFE7200 is selected due to its non-toxicity. In future, isopentane should be considered due to its higher RI.

After extracting the microfluidic sample and sandwiching it between a sapphire disc and an EM grid, the samples can be imaged by cryo-iLM and even by cryo-STED [2]. Furthermore, the samples can be extracted and transferred into a cryo-SEM and further imaged once exposed by FIB milling. While these methods are shown in the thesis, further correlative methods, such as freeze-substitution, microtomy, expansion microscopy, and TEM could also be utilized, with the same sample, allowing it to seamlessly fit into many cryo-correlative workflows in the future.

[1] M. Fuest, G. M. Nocera, M. M. Modena, D. Riedel, Y. X. Mejia and T. P. Burg, "Cryofixation during live-imaging enables millisecond time-correlated light and electron microscopy," Journal of Microscopy, vol. 272, no. 2, pp. 87-95, 2018. [2] N. Faul, S.-Y. Chen, C. Lamberz, M. Bruckner, C. Dienemann and T. P. Burg, "forthcoming: Cryo-iCLEM: CryoCorrelative Light and Electron Microscopy with Immersion Objectives," Journal of Structural Biology, 2024.

Arbeitsabläufe der Kryofixierung und der korrelativen Bildgebung mit Licht- und Elektronenmikroskopie sind ein Schlüsselelement für das Verständnis strukturbiologischer Fragen. Zusätzlich zu den hohen strukturellen Auflösungen, die erreicht werden, wird die Frage nach zeitlich hoch aufgelösten Bildern immer relevanter. In dieser Arbeit wird eine Kryofixierungsmethode vorgestellt, die eine zeitliche Auflösung ermöglicht. Darüber hinaus wird gezeigt, wie sie sich in bestehende Arbeitsabläufe einfügt und die Bildgebung korrelativ zu neuen oder etablierten Methoden bei kryogenen Temperaturen ermöglicht.

Das verwendete Kryofixierungssystem basiert auf dem von Fuest et al. entwickelten System [1]. Durch neuartige Heizmaterialien werden hohe Kühl- und Heizraten ermöglicht, die Bildgebung verbessert, Robustheit geschafft und die Probenextraktion ermöglicht. Dies ermöglicht korrelative Bildgebung mit der Kryo-Immersionslichtmikroskopie (cryo-iLM) und Kryo-Rasterelektronenmikroskopie (cryo-SEM) mit fokussiertem Ionenstrahlfräsen (FIB). Das System besteht aus einem dünnen mikrofluidischen Kanal, der die biologische Probe enthält. Der Kanal wird auf einem Dünnschicht-Titanheizer mit Kühlkörper platziert. Der Kühlkörper wird auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff heruntergekühlt, während der Heizer die Probe auf physiologische Temperaturen regelt. Durch Ein- und Ausschalten des Heizelements wird dann eine schnelle Kryofixierung und ein schnelles Auftauen der Probe möglich. Die geschätzten Abkühlraten liegen im Bereich von ~2-3 · 10000 K/s, die Auftauraten bei ~1 · 10000 K/s.

Durch die mikrofluidische Komponente können Proben im System manipuliert werden. Dies wird demonstriert, indem rote Blutkörperchen (RBC) durch enge Mikrokanäle gepresst werden, um ihre Verformung zu erfassen. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Membranstruktur der roten Blutkörperchen intakt bleibt und die Zilien von Chlamydomonas reinhardtii (CC-6012) auch ohne den Einsatz von Kryoprotektoren erhalten werden können. Außerdem werden CC-125 benutzt, um das Überleben von Zellen beim Einfrieren und Auftauen zu testen. Mit dem derzeitigen Aufbau und der derzeitigen Geschwindigkeit überleben diese Zellen nicht. Korrelative Bildgebung zu cryo-iLM wird zum ersten Mal an RBC- und CC-6012-Proben demonstriert.

Um nach der Entnahme aus dem Kryofixierungssystem weitere korrelative Bildgebung mit cryo-iLM zu ermöglichen, ist es wichtig, ein geeignetes Immersionsmedium zu finden. Da Messungen des Brechungsindex (RI) bei diesen niedrigen Temperaturen komplex sind, wurde eine Methode entwickelt, die den RI ausgewählter Medien mit Hilfe asymmetrischer optischer Gitter misst. Die Gitter wurden durch selektives Ätzen sowie durch Graustufenlithographie erzeugt. Der Brechungsindex von HFE7200, HFE7100 und Isopentan sowie einiger Mischungen wurde bis zu -140 °C gemessen. Für die spätere Bildgebung mit cryo-iLM wird HFE7200 wegen seiner geringen Toxizität ausgewählt, aber Isopentan sollte in Zukunft wegen seines höheren RI in Betracht gezogen werden.

Nachdem die mikrofluidische Probe entnommen wird, kann sie mit cryo-iLM, hochauflösendem cryo-STED und cryo-SEM abgebildet werden [2]. Während diese Methoden in der Dissertation gezeigt werden, könnten in der Zukunft auch weitere korrelative Methoden wie Gefriersubstitution, Mikrotom und TEM mit der gleichen Probe verwendet werden, so dass sie sich in Zukunft nahtlos in viele kryokorrelative Arbeitsabläufe einfügen lässt.

[1] M. Fuest, G. M. Nocera, M. M. Modena, D. Riedel, Y. X. Mejia and T. P. Burg, "Cryofixation during live-imaging enables millisecond time-correlated light and electron microscopy," Journal of Microscopy, vol. 272, no. 2, pp. 87-95, 2018. [2] N. Faul, S.-Y. Chen, C. Lamberz, M. Bruckner, C. Dienemann and T. P. Burg, "forthcoming: Cryo-iCLEM: CryoCorrelative Light and Electron Microscopy with Immersion Objectives," Journal of Structural Biology, 2024.