Strukturbasiertes Design, Synthese und Evaluation dual-kovalenter Immunoproteasom- und SARS-CoV-2 Mᵖʳᵒ-Inhibitoren

In dieser Arbeit wurden Peptid-Inhibitoren für die β5i-Untereinheit des Immunoproteasoms (iCP) und der Main-Protease (Mᵖʳᵒ) von SARS-CoV-2 synthetisiert. Das Immunoproteasom ist bei verschiedenen Krebsarten überexprimiert, was es zu einem interessanten Ziel für die Tumortherapie macht. Es wird angenommen, dass das iCP an vielen Autoimmunerkrankungen beteiligt oder sogar der Auslöser ist. Eine große Herausforderung ist hier die selektive Inhibition der verschiedenen Proteasomtypen. Der Ausbruch der Coronavirus-Pandemie im Jahre 2019 hat auch das Coronavirus in den Fokus der Forschung gerückt. Im Verlauf dieser Arbeit wurden Versuche unternommen, Inhibitoren zu entwickeln und zu synthetisieren, die die Replikation dieses Virus unterdrücken. Diese Arbeit basiert auf den Vorarbeiten der Dissertation von Dr. Daniel Stubba und meiner Masterarbeit. Dr. Stubba ist es gelungen, Inhibitoren für das konstitutive Proteasom (cCP) zu synthetisieren. Die ersten dual-kovalenten Peptid-Inhibitoren wurden im Rahmen meiner Masterarbeit synthetisiert. Zu Beginn dieser Arbeit wurden Simulationen durchgeführt um die Plausibilität der zu synthetisierenden Inhibitoren zu überprüfen. Zum einen sollte das Peptidrückgrat verlängert werden, um Tetrapeptide zu erhalten und zum anderen sollten dual-kovalente Inhibitoren analog zu meiner Masterarbeit synthetisiert werden. Nachdem die Simulationen erfolgreich abgeschlossen waren, wurden die ersten dual-kovalenten Proteasom-Inhibitoren auf ihre Inhibtion im isolierten Protein des Proteasoms getestet. Zellassays, die anschließend durchgeführt wurden, lieferten klarere Hinweise darauf, ob die Verlängerung des Peptid Peptidrückgrats oder das dual-kovalente Konzept zu Einschränkungen im lebenden Organismus führen.In beiden Assay-Typen wurde jedoch gute Inhibitonen erreicht, weshalb dieses Konzept weiterverfolgt wurde. Neben der Entwicklung von Proteasom-Inhibitoren sollten auch Inhibitoren für die Mᵖʳᵒ, die ein Cystein als katalytische Aminosäure besitzt, synthetisiert werden. Aufgrund des iCP war Cystein ein bekanntes Ziel für kovalente Bindungen. Die Aktivierung des katalytischen Cysteins von Mᵖʳᵒ und die daraus resultierende Erhöhung der Reaktivität führte zu dem Ziel, dass neue, weniger reaktive Warheads eingeführt werden sollten. Für die Auswahl der Warheads wurden Vorversuche durchgeführt, und anschließend wurde versucht, die vielversprechendsten Warheads als Peptid-Inhibitoren zu sythesisieren. Eine große Anzahl von neuen Warheads wurden erfolgreich eingeführt. Anschließend wurden die synthetisierten Inhibitoren in Glutathion-Assays auf ihre Stabilität in wässrigem Puffer und Reaktivität gegenüber unspezifischem Cystein getestet. Darüber hinaus wurden Assays des Immunproteasoms, des konstitutiven Proteasoms, sowie der isolierten Mᵖʳᵒ durchgeführt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Inhibitoren für die Mᵖʳᵒ von SARS-CoV-2 erfolgreich synthetisiert werden konnten. Darüber hinaus konnte die Basis für die Variation und Modifikation von Warheads gelegt werden. Außerdem wurden aktive und selektive Inhibitoren für das Proteasom weiterentwickelt und erfolgreich hergestellt.

In this work peptide inhibitors for the β5i subunit of the immunoproteasome (iCP) and the main protease (Mᵖʳᵒ) of SARS-CoV-2 were synthesized. The immunoproteasome is overexpressed in various cancer types, making it an interesting target for tumor therapy. The iCP is also believed to be involved or even be the trigger in many autoimmune diseases. A major challenge here is the selective inhibition of the different proteasome types. The outbreak of the coronavirus pandemic in 2019 also brought the coronavirus into focus of research. In the process of this work, attempts were made to synthesize inhibitors that suppress the replication of this virus. This work is based on the preliminary work of Dr. Daniel Stubba's dissertation and my master thesis. Dr. Stubba was able to successfully synthesize inhibitors for the constitutive proteasome (cCP). The first dual-covalent peptide inhibitors were synthesized as part of my master thesis. At the beginning of this work, simulations were performed to check the plausibility of the inhibitors planned to be synthesized. On the one hand, the peptide backbone should be extended to obtain tetrapeptides, and on the other hand, dual-covalent inhibitors should be synthesized analog to my master thesis. After the simulations were successfully completed, the first dual-covalent proteasome inhibitors were tested for their inhibition in the isolated protein of the proteasome. Cell assays, which were performed afterwards, provided clearer indications whether the extension of the peptide backbone or the dual covalent concept would cause restrictions in the living organism. However, good inhibition was achieved in both assay types, which is why the concept was pursued further. In addition to the development of proteasome inhibitors, inhibitors for Mᵖʳᵒ, which has a cysteine as a catalytic amino acid, should be synthesized. Due to the iCP, cysteine was a known target for covalent binding. The activation of the catalytic cysteine of Mᵖʳᵒ and the resulting increase in reactivity led to the goal that new, less reactive warheads should be introduced. For the selection of warheads preliminary tests were performed and then the most promising warheads were attempted to be sythesizied as peptide inhibitors. A large number of new warheads were successfully introduced. Afterwards the synthesized inhibitors were tested in glutathione assays for their stability in aqueous buffer and reactivity towards unspecific cysteine. In addition, assays were performed on the isolated protein of the immunoproteasome, the constitutive proteasome, as well as the isolated Mᵖʳᵒ. In summary it can be said that inhibitors for the Mᵖʳᵒ of SARS-CoV-2 could be successfully synthesized. In addition the basis for variation and modification of warheads could be laid. Finally the inhibitors for the proteasome were successfully developed further, active and selective inhibitors were obtained.