Generation and evaluation of protein-drug conjugates for targeted tumor therapy

As cancer, with its numerous subtypes, has emerged as a leading cause of death among non-communicable diseases, there is a pressing need for novel treatment methods to enhance patient outcomes and potentially surpass existing therapeutic strategies. Historically, surgery, radiation therapy, and chemotherapy were among the first successful treatment modalities, often used in conjunction. However, both radiation therapy and chemotherapy can cause significant adverse effects by damaging healthy tissue. Consequently, research has focused on identifying alternative or complementary methods, leading to the development of immunotherapy, targeted therapy and photodynamic therapy. While immunotherapy aims to re-engage the body’s immune system to combat malignancies, targeted therapy and photodynamic therapy employ mechanisms that include selective agent delivery or the mitigation of non-specific actions. Despite their advancements, each of these therapeutic approaches presents challenges, such as off-target effects and reduced efficacy due to insufficient agent concentration or potency at the tumor site. These limitations critically influence the therapeutic index (TI) of the compounds employed in treatment. Thus, a primary objective in cancer research is to expand this "therapeutic window" by achieving both a low minimum effective dose and a high maximum tolerated dose for the therapeutic agents of interest. Especially in targeted therapy, enhancing TI can be pursued through various strategies. These include the use of novel agents, such as more potent toxins, the implementation of diverse targeting strategies, and the exploration of new linker systems that facilitate more specific release of therapeutic agents. Within this thesis, the approach of targeted therapy was further investigated. Thus, following the concept of antibody-drug conjugates (ADCs), different conjugates were designed, tuning every building block an ADC comprises: targeting protein, linker system and payload. Starting with the payload, the monoclonal antibody (mAb) trastuzumab (anti-Her2) was loaded with a highly potent derivative of cryptophycin (Cp), which allowed the traceless release of the drug employing a valine-citrulline-para-benzyl alcohol (Val-Cit-PAB) linker. The generated conjugates displayed high potency even on cell lines with moderate receptor expression. Focusing on novel conjugation strategies, Pyrococcus horikoshii biotin-protein ligase (PhBL) was introduced as enzyme for site-specific generation of immunoconjugates. To this end, the human-derived p67 biotin acceptor domain was fused to trastuzumab to enable the enzyme-mediated introduction of the biotin derivative desthiobiotin azide. This allowed the subsequent attachment of a cargo of desire, being AlexaFluor® and Val-Cit-PAB-monomethyl-auristatin E (MMAE). The successful and site-specific generation of conjugates was proven with hydrophobic interaction chromatography (HIC) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In cellular proliferation assays, the ADCs displayed low single-digit nanomolar potency. Furthermore, the dextramab format introduced by Schneider et al. was applied to generate nanobody-dextran conjugates equipped with multiple photosensitizers (PSs) to obtain compounds with enhanced tissue penetration behavior in comparison with full length antibodies that still feature high target selectivity and the low off target toxicity of PSs. These constructs were tested in spheroidal penetration assays as well as 2D and 3D photodynamic therapy assays, displaying good tissue penetration and potent cell killing behavior.

Krebs, mit seinen vielen Varianten, ist inzwischen eine der häufigsten Todesursachen unter nicht-übertragbaren Krankheiten. Daher besteht äußerste Dringlichkeit bei der Entwicklung und Verbesserung bestehender Therapiemethoden sowie der Erforschung neuer Behandlungsmöglichkeiten, welche die bestehenden unterstützen oder gar ersetzen können. Während operative Eingriffe, Radio- und Chemotherapie als erste Behandlungsmethoden und oft auch in Kombination durchaus erfolgreich eingesetzt wurden und weiter ein wichtiger Bestandteil der Krebstherapie sind, stellen die bisweilen starken unerwünschten Nebenwirkungen von Radio- und Chemotherapie eine große Herausforderung dar. Daher wurden alternative Ansätze erforscht und weiterverfolgt, die eine Verringerung jener Nebenwirkungen ermöglichen. Diese Ansätze schließen Immuntherapie, zielgerichtete Therapie und photodynamische Therapie ein. Während Immuntherapie vor allem darauf abzielt, das körpereigene Immunsystem für den Kampf gegen den Tumor zu rekrutieren, setzen zielgerichtete und photodynamische Therapie Mechanismen ein, die eine selektive Wirkstoffabgabe oder die Vermeidung unspezifischer Effekte beinhalten. Trotz großer Fortschritte sind beide therapeutische Ansätze immer wieder durch unspezifische Wirkung oder durch unzureichende Effektivität auf Grund zu niedriger Wirkstoffkonzentration oder nicht ausreichender Potenz am Tumor selbst limitiert. Diese Einschränkungen beeinflussen den therapeutischen Index (TI), auch therapeutisches Fenster genannt. Diese beschreibt die Konzentrationsspanne zwischen minimal effektiver Dosis (MED) und maximal tolerierter Dosis (MTD) bei Behandlung eines Patienten. Folglich ist das Ziel der Forschung, dieses „Fenster“ durch Verringerung der MED oder Erhöhung der MTD zu verbreitern und die Effizienz der Therapie zu steigern. Besonders im Bereich der zielgerichteten Therapie kann die Verbesserung des TI durch viele unterschiedliche Faktoren erreicht werden. Diese schließen die Nutzung neuer Wirkstoffe wie neuer potenter Toxine, den Einsatz unterschiedlicher Strategien zur Adressierung des Tumors und die Entwicklung neuer Linkersysteme, welche die spezifischere Freisetzung des Wirkstoffs ermöglichen, ein. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Ansatz der zielgerichteten Therapie weiterverfolgt. So wurden entsprechend dem Konzept von Antikörperwirkstoffkonjugaten (engl.: antibody-drug conjugate, ADC) unterschiedliche Konjugate entworfen, welche Modifikationen an jedem Bestandteil von ADCs enthielten: dem Tumor-adressierenden Protein, dem Linkersystem sowie dem Wirkstoff. Beginnend mit dem Wirkstoff wurde der monoklonale Antikörper (engl.: monoclonal antibody, mAb) Trastuzumab (Trz, anti-Her2) mit einem Derivat des hochpotenten antimitotischen Toxins Cryptophycin (Cp) beladen. Das Derivat des Toxins war so modifiziert, dass es die spurenlose Freisetzung desselben nach Spaltung eines Valin-Citrullin-para-benzylalkohol (Val-Cit-PAB) Linkers ermöglichte. Es wurden drei unterschiedliche Trz-Cp-Konjugate hergestellt, indem das Linker-Toxin über Michael-Addition entweder an die Zwischenketten-Cysteine der Gelenkregion des mAbs oder an mittels THIOMABTM-Technologie artifiziell eingefügte Cystein-Seitenketten in der leichten Kette von Trz konjugiert wurde. Dabei wurden Konjugate mit Wirkstoff-zu-Antikörper-Verhältnissen (engl.: drug-to-antibody ratio, DAR) von 1.5, 3 und 6 erhalten. Die generierten Konjugate zeigten auch auf moderat Her2-exprimierenden Zelllinien eine starke antiproliferative Wirkung. Vor allem die DAR 3 und DAR 6 Varianten wiesen eine höhere Potenz als das Referenzkonjugat mit MMAE (DAR 6) auf, wobei vor allem die DAR 3 THIOMABTM Variante durch zu bevorzugende biophysikalische Eigenschaften ein Kandidat für weitere Studien ist. Mit Blick auf neuartige Konjugationsstrategien wurde die Biotin-Protein-Ligase von Pyrococcus horikoshii (PhBL) als Enzym für die ortsspezifische Herstellung von Immunkonjugaten eingeführt. Zu diesem Zweck wurde die humane Biotin-Akzeptor-Domäne p67 entweder am C-terminalen Ende der leichten oder der schweren Kette an Trastuzumab fusioniert, um die enzymvermittelte Einführung des Biotin-Derivats Desthiobiotinazid zu ermöglichen. Dies ermöglichte die anschließende Kopplung einer gewünschten Beladung (AlexaFluor® oder Val-Cit-PAB-Monomethyl-Aristatin E, MMAE) mittels spannungsgetriebender Azid-Alkyl Cycloaddition. Die erfolgreiche und ortsspezifische Generierung der Konjugate wurde mit hydrophober Interaktionschromatographie (HIC) und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nachgewiesen. In zellulären Proliferationstests zeigten beide ADCs eine niedrige einstellige nanomolare Potenz, wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Fusionsantikörpern festgestellt werden konnten. Lediglich auf hoch Fc-γIIIa-Rezeptor exprimierenden Zellen zeigte die Variante mit an die schwere Kette fusionierter p67-Domäne eine höhere Wirksamkeit als die an der leichten Kette modifizierte Variante. Dies ist vermutlich auf sterische Hinderung der Erreichbarkeit der Fc-Region des mAbs durch die p67-Domäne zu erklären. Darüber hinaus wurde das von Schneider et al. eingeführte Dextramab-Format zur Herstellung von mit Photosensibilisatoren (PS) beladenen Einzeldomänenantikörper-Dextran-Konjugaten verwendet. Diese Konjugate sollten ein verbessertes Gewebepenetrationsverhalten im Vergleich zu Volllängen-Antikörpern unter Bewahrung derer hohen Zielselektivität aufweisen und diese mit der niedrigen zielunspezifischen Toxizität von PS verbinden. Außerdem wurde der Einfluss der Größe des verwendeten Dextran-Gerüsts untersucht, indem Dextrane eines durchschnittlichen Molekulargewichts von 1000, 5000 und 10000 g/mol verwendet wurden. In ersten Versuchen zeigten mit dem Fluorophor Cy5 beladene Konjugate mit einem monoparatopischen Einzeldomänenantikörper (engl.: nanobody, NB) hervorragendes Penetrationsverhalten in Sphäroiden, wobei das Konjugat mit 5000 g/mol Dextran schneller in das Sphäroid eindrang als das Konjugat mit 10000 g/mol Dextran. Bei mit PS beladenen Konjugaten einem biparatopischem NB wurde deutlich schlechtere Penetration beobachtet, wobei kein Unterschied zwischen den Konjugaten mit unterschiedlich großen Dextrangerüsten festgestellt werden konnte. Das schlechtere Penetrationsverhalten wurde auf das biparatopische Bindungsverhalten des genutzten NBs zurückgeführt. Dennoch zeigten die Konstrukte in 2D- und 3D-Tests zur photodynamischen Therapie starke zelltötendes Wirkung.