Metabolic engineering der Taxolbiosynthese in Saccharomyces cerevisiae

Taxol ist ein terpenoider Naturstoff, der im Rahmen einer weltweiten Suche nach biologisch aktiven Substanzen in der Eibenrinde entdeckt wurde. Aufgrund seiner antikanzerogenen Wirkung und seines speziellen Wirkungsmechanismus wird er heute weltweit als Medikament gegen zahlreiche Krebsarten eingesetzt. Die Gewinnung von Taxol basiert zum Einen auf der Isolierung der in größeren Mengen biosynthetisierten Vorstufen Baccatin III oder 10-Deacetylbaccatin III, die anschließend chemisch weiter zu den entsprechenden Generika Taxotere oder Paclitaxel umgesetzt werden. Zum anderen wird Taxol aus Zellkulturen extrahiert. Es existieren bisher keine erfolgreichen Methoden zur stabilen genetischen Veränderung von Taxus spp., sodass eine Optimierung der Taxolbiosynthese ausschließlich über die Verbesserung von Fermentationsbedingungen der Pflanzenzellkulturen erfolgen kann und dementsprechend begrenzt ist. Der Einsatz rekombinanter Mikroorganismen zur Produktion der Verbindungen verkörpert daher eine prinzipiell zeit- und kostengünstigere Methode der Synthese. Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch Optimierung des Hefe-eigenen Primärmetabolismus und zusätzlichen Expression von Taxolbiosynthesegenen ein Saccharomyces cerevisiae-Stamm generiert, der in der Lage ist, die bisher größte bekannte Menge an der Taxolvorstufe Taxadien zu produzieren. Durch Fusionierung der entsprechenden DNA-Fragmente entstand weiterhin ein rekombinanter Hefestamm, der mithilfe eines Genclusters Taxadien herzustellen vermag. Somit wurde eine Plattform entwickelt, die mittels Expression weiterer Taxolbiosynthesegene die Genese funktionalisierter Taxane ermöglicht. Durch die zusätzliche Expression des Clusters mithilfe eines pYACs konnte ein alternativer und innovativer Ansatz des metabolic engineerings zur rekombinanten Produktion von Sekundärmetaboliten aufgezeigt werden.

Taxol embodies a terpenoid natural product, which was discovered in the bark of the yew tree within a worldwide search for biologically active substances. Today it is used as medical treatment against various types of cancer as a result of its anticarcinogenic properties and its unique mode of action. At present the recovery of taxol is based on extraction from plant cell cultures or isolation of the precursors baccatin III or 10-deacetylbaccatin III, respectively, which are both synthesized by the plant in bigger amounts and can be chemically modified to gain the generic drugs Taxotere or Paclitaxel. However, no successful methods for stable transformation of Taxus spp. have been developed so far. Hence, advancement of taxol biosynthesis can only be achieved by optimizing the fermentation conditions of plant cell cultures and therefore is very limited. Thus the use of recombinant microorganisms for production represents a time- and cost-efficient alternative. This work dealt with the optimization of primary metabolism of the yeast Saccharomyces cerevisiae and the additional expression of taxol biosynthetic genes. The resulting strain showed the highest amount of biosynthesized taxol precursor taxadiene published to date. By fusing the respective DNA-fragments, a recombinant yeast strain capable of producing taxadiene by the means of a gene cluster was generated. As a consequence, a platform was developed permitting the genesis of functionalized taxanes by expression of numerous taxol biosynthetic genes via the same strain.