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Application of Transketolase from Geobacillus stearothermophilus for Broad Synthesis of N-Arylhydroxamates and Development of a Novel High-Throughput Reactivity Assay

Fúster Fernández, Inés (2022):
Application of Transketolase from Geobacillus stearothermophilus for Broad Synthesis of N-Arylhydroxamates and Development of a Novel High-Throughput Reactivity Assay. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00022845,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Application of Transketolase from Geobacillus stearothermophilus for Broad Synthesis of N-Arylhydroxamates and Development of a Novel High-Throughput Reactivity Assay
Language: English
Abstract:

In nature, transketolase (TK, EC 2.2.1.1) catalyzes the reversible and stereospecific transfer of a C2-ketol moiety to the carbonyl end of a variety of aldehydes. Recently, the TK from Geobacillus stearothermophilus (TKgst) was modified by the Fessner group to accept benzaldehyde as an unnatural acceptor substrate. Because of the high electronic and structural similarity between nitrosobenzene and benzaldehyde, TKgst variants have been successfully developed and used to convert nitrosoarenes as alternative electrophilic substrates into the corresponding N-arylhydroxamic acids (HA). HAs form a class of compounds of exceptional pharmaceutical, biochemical and industrial importance; among other things, some HA possess antitumor properties. In the first chapter, a variety of para-, meta-, and ortho- mono- and disubstituted nitrosoarenes were tested using the TKgst L382N/D470S variant, which was designed for improved acceptance of benzaldehyde with hydroxypyruvate as the donor substrate. In the second chapter, a novel colorimetric endpoint assay for the screening of TKgst was developed, which is applicable in high throughput based on the ability of HA to chelate metals, such as iron(III), and it allows the determination of the HA products generated during enzymatic catalysis. In the third chapter, it was hypothesized that N-aryl-HA presumably have similar pharmacological properties to the well-known C-aryl-HA because both constitutional isomers have the ability to chelate metal ions such as iron(III) and zinc(II) in a similar way. To test this hypothesis, the readily accessible, potent HDACi N-hydroxy-4-(4-phenylbutyrylamino)benzamide (HTPB) and related N-aryl-HA were chemically synthesized. The hypothesis was confirmed by means of in vitro HDAC inhibition tests. In addition, it was shown in a laboratory proof-of-concept that HA 30, which inhibits hHDAC8 by 60 % at a concentration of 100 μM, can be prepared by TKgst-mediated catalysis. Since enzymes offer a variety of benefits, this opens up the exciting application of biocatalysts for the generation of retro-HA with biomedical properties.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Transketolase (TK, EC 2.2.1.1) katalysiert in Natur die reversible und stereospezifische Übertragung einer C2-Ketoleinheit auf das Carbonylende einer Vielzahl von Aldehyden. Kürzlich wurde die TK aus Geobacillus stearothermophilus (TKgst) vom Arbeitskreis Fessner dahingehend modifiziert, dass sie Benzaldehyd als nichtnatürliches Akzeptorsubstrat akzeptiert. Aufgrund der hohen elektronischen und strukturellen Ähnlichkeit zwischen Nitrosobenzol und Benzaldehyd wurden TKgst-Varianten erfolgreich entwickelt und verwendet, um Nitrosoarene als alternative elektrophile Substrate in die entsprechenden N-Arylhydroxamsäuren (HA) umzuwandeln. HAs bilden eine Klasse von Verbindungen mit außergewöhnlicher pharmazeutischer, biochemischer und industrieller Bedeutung; unter Anderem besitzen manche HA Antitumor-Eigenschaften. Im ersten Kapitel wurde eine Reihe unterschiedlich para-, meta- und ortho-mono- und disubstituierter Nitrosoarene unter Verwendung der TKgst L382N/D470S-Variante getestet, die für eine verbesserte Akzeptanz von Benzaldehyd mit Hydroxypyruvat als Donorsubstrat entwickelt worden war. Im zweiten Kapitel wurde ein neuartiger kolorimetrischer Endpunkt-Assay für das Screening der TKgst entwickelt, der auf der Grundlage der Fähigkeit von HA, Metalle wie Eisen(III) zu chelatieren, im Hochdurchsatz anwendbar ist und die Bestimmung des während der enzymatischen Katalyse erzeugten HA-Produkts ermöglicht. Im dritten Kapitel wurde die Hypothese aufgestellt, dass N-Aryl-HA vermutlich ähnliche pharmakologische Eigenschaften wie die wohlbekannte C-Aryl- HA besitzen, weil beide Konstitutionsisomere die Fähigkeit haben, Metallionen wie Eisen(III) und Zink(II) in ähnlicher Weise zu chelatieren. Um diese Hypothese zu testen, wurden das leicht zugängliche potente HDACi N-hydroxy-4-(4-phenylbutyrylamino)benzamid (HTPB) und verwandte N-Aryl-HA chemisch synthetisiert. Die Hypothese wurde durch In-vitro-HDAC-Hemmungstests bestätigt. Außerdem wurde in einem Proof-of-Concept Verfahren gezeigt, dass 30, das bei einer Konzentration von 100 μM hHDAC8 um 60 % hemmt, mittels TKgst-vermittelter Katalyse hergestellt werden kann. Da Enzyme eine Vielzahl von Vorteilen bieten eröffnet dies die aufregende Anwendung von Biokatalysatoren für die Erzeugung von Retro-HA mit biomedizinischen Eigenschaften.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: IX, 249 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Organ Chemistry
Date Deposited: 09 Nov 2022 14:06
Last Modified: 11 Nov 2022 07:24
DOI: 10.26083/tuprints-00022845
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-228452
Referees: Fessner, Prof. Dr. Wolf-Dieter ; Kolmar, Prof. Dr. Harald
Date of oral examination: 24 October 2022
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/22845
PPN: 501431063
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