TU Darmstadt / ULB / TUprints

Design und Synthese selektiver Nek1 Inhibitoren

Pilakowski, Johannes (2022):
Design und Synthese selektiver Nek1 Inhibitoren. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00020849,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Johannes Andreas Pilakowski.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Design und Synthese selektiver Nek1 Inhibitoren
Language: German
Abstract:

Die NIMA-related kinase 1 (Nek1) ist eine von elf humanen Orthologen, der im Schimmelpilz Aspergillus nidulans vorkommenden Never in Mitosis A Kinase. Nek1 spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung bestimmter Polycystischer Nieren, Ziliogenese, Apoptose (über VDAC), DNA-Reparatur und der Zellzykluskontrolle. Bei komplexen DNA-Doppelstrangbrüchen greifen humane Zellen vorzugsweise auf die fehlerarme Homologe Rekombination (HR) zurück. Die HR benötigt eine zweite DNA-Kopie, die nur in proliferierenden Zellen und damit im Besonderen in Krebszellen vorhanden ist. In Gliom- und Nierenkrebszellen mit Nek1-Überexpression wurde ein Zusammenhang zwischen der Nek1-Überexpression und Therapieresistenz beobachtet. In Schilddrüsen- und Speiseröhrenkrebs wurde weiterhin ein Zusammenhang zwischen Nek1-Überexpression und Parametern gefunden, welche die Aggressivität von Tumoren beschreiben, wie z. B. Multifocalität, Invasivität, Tumorgrad und Tumorgröße. Daher stellt Nek1 ein interessantes Traget für die Krebstherapie dar. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung von Kinaseinhibitoren aus Screening Hits mit Benzothiazin- und Aminopyrazol-Gerüsten, so wie einem aus Strukturanalysen abgeleiteten 7-Azaindol-Gerüst. Das rationale Design der Inhibitoren wurde mit Protein/Liganden-Dockings und anhand von Struktur-Aktivitäts-Beziehungsanalysen (SAR) durchgeführt. Die in dem iterativen Prozess entwickelten Inhibitoren wurden synthetisiert und in einem radiometrischen Phosphorylierungsassay getestet. Die sechs aktivsten Inhibitoren mit IC50-Werten von 11.5 - 140 nM wurden näher untersucht. Die Selektivität wurde in einem Phosphorylierungsassay gegen 5 weitere Kinasen getestet. Um die Eignung für zelluläre Versuche zu beurteilen, wurden physiko-chemische Parameter, wie die Löslichkeit, der logP-Wert und die Stabilität in Kulturmedium bestimmt. Die Zellpermeabilität von zwei Inhibitoren konnte in einem Caco-2 Zellpermeabilitätsassay gezeigt werden. In einem Zebrabärbling-Embryonenassay wurde keine auffällige Toxizität gefunden. Kooperationspartner haben zwei Inhibitoren in einem fluoreszenzmikroskopischen Zebrabärbling-Embryonen-Entwicklungsassay untersucht und messbare Vergrößerungen der Vornieren beobachtet. In einer weiteren Kooperation wurden die sechs aktivsten Inhibitoren in verschiedenen Zellkulturexperimenten (Wachstumsassay, DNA-Reparaturassays) untersucht und dosisabhängige Beeinträchtigungen der Homologen Rekombination beobachtet.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

The NIMA-related kinase 1 (Nek1) is one of eleven human orthologs of the Never in Mitosis A Kinase found in Aspergillus nidulans. Nek1 plays important roles in the development of certain types of polycystic kidney disease, ciliagenesis, apoptosis (via VDAC), DNA repair and cell cycle control. In case of complex DNA double strand breaks human cells preferably use low-error Homologous Recombination (HR) to repair the damage. HR requires a second set of DNA, which is only present in dividing cells, especially in cancer cells. A connection was shown between Nek1 over-expression and therapy resistance in glioma and kidney cancer cells. Also, a connection between Nek1 over-expression in thyroid and esophagus cancer and parameters describing tumor aggressiveness like multifocality, invasion, tumor grade and tumor size. Thus, Nek1 emphasizes as interesting target for cancer therapy. This work describes the development of kinase inhibitors originating from screening hits with benzothiazine and aminopyrazole scaffolds, as well as a 7-azaindole scaffold derived of structural analysis. Rational design of these inhibitors was assisted by protein-ligand-dockings and structure-activity-relationship (SAR) analysis. The inhibitors, designed in an iterative process, were synthesized and tested in a radiometric phosphorylation assay. The six most potent inhibitors, showing IC50-values of 11.5 - 140 nM, were studied further. Selectivity was tested in a radiometric phosphorylation assay against 5 kinases. To evaluate the suitability für cellular experiments, several physico-chemical properties like solubility, log-P value and stability in culture media was determined. Cell permeability of two inhibitors was shown in a Caco-2 cell permeability assay. No conspicuous toxicity was found in a zebrafish embryo assay. Cooperation partner found measurable expansion of zebrafish pronephros for two inhibitors in an embryonic zebrafish kidney development assay. In another cooperation the six most potent inhibitors were characterized in cell culture experiments (cell growth assay and DNA-repair assays), where dose-dependent inhibition of homologous recombination was observed.

English
Place of Publication: Darmstadt
Collation: XX, 262 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Organ Chemistry
TU-Projects: DFG|GRK1657|GRK 1657
Date Deposited: 10 Oct 2022 12:00
Last Modified: 11 Oct 2022 09:18
DOI: 10.26083/tuprints-00020849
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-208497
Referees: Schmidt, Prof. Dr. Boris ; Schmitz, Prof. Dr. Katja
Date of oral examination: 28 February 2022
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/20849
PPN: 500238537
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