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Phase Separation of the Methyl-CpG-Binding Domain (MBD) Protein Family Underlies Heterochromatin Organization

Zhang, Hui (2022):
Phase Separation of the Methyl-CpG-Binding Domain (MBD) Protein Family Underlies Heterochromatin Organization. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00020494,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Phase Separation of the Methyl-CpG-Binding Domain (MBD) Protein Family Underlies Heterochromatin Organization
Language: English
Abstract:

In the last decade, phase separation has been proposed as a mechanism for the formation of a variety of subcellular compartments such as chromatin compartmentalization in eukaryotic cell nuclei. Yet, the requirements for chromatin compartmentalization have not been well characterized and several overlapping factors have been implied. This study aimed to gain insight into the function and underlying mechanisms of the MBD family proteins (MBDs) on chromatin organization. Firstly, I characterized the phase separation properties, functions, and dynamics of the MBDs in vitro and in vivo. I found that the MBDs have different phase separation properties and functions in heterochromatin organization. In vitro, MBD1∆CxxC3 formed only irregular aggregates, while MBD2, MBD3, MBD4, and MeCP2 formed liquid-like spherical droplets in certain conditions. In vivo, MBD1∆CxxC3 and MBD3 did not influence heterochromatin compartment size, while MBD1, MBD2, MBD4, and MeCP2 promoted the heterochromatin clustering in a dose-dependent manner. Besides, MBD1, MBD1∆CxxC3, and MBD4 were shown to decrease the roundness of heterochromatin compartments, while MBD2, MBD3, and MeCP2 did not. I also detected the molecule exchange dynamics of MBDs in between heterochromatin compartments and surrounding environments and found that all MBDs are highly dynamic. In conclusion, the LLPS properties were: MeCP2 > MBD2 > MBD3 > MBD4 ≥ MBD1∆CxxC3. The functions in heterochromatin compartment size were: MeCP2 > MBD4 > MBD2 > MBD1∆CxxC3 ≈ MBD3. The functions in heterochromatin compartment roundness were: (MBD3 >) MeCP2 > MBD2 > MBD4 > MBD1∆CxxC3. The protein mobility was: MeCP2 < MBD2 < MBD1∆CxxC3 < MBD4. The immobile fractions were: MeCP2 ≈ MBD2 > MBD4 ≈ MBD1∆CxxC3. Thus, the heterochromatin organization could be regulated by the MBDs mediated phase separation. MBD2 and MeCP2 show the highest liquid-liquid phase separation (LLPS) properties in vitro and more significantly influence the heterochromatin compartment structure. Secondly, I elucidated the functional difference of MBD2 isoforms in vivo and in vitro. MBD2 has three isoforms, MBD2a, MBD2b, and MBD2c. MBD2a is the longest isoform and contains N-terminus, MBD-TRD, and the C-terminus, while MBD2b and MBD2c contain the conserved MBD-TRD, but lack either the N-Terminus (MBD2b) or the C-Terminus (MBD2c). All MBD2 isoforms showed the ability of phase separation with distinct properties. MBD2b exhibited overall similar but weaker phase separation properties than the full-length MBD2a. MBD2b was less enriched in heterochromatin compartments and promoted the heterochromatin compartment clustering to a lesser extent than MBD2a. MBD2b showed a faster molecule exchange between heterochromatin compartments and surrounding environments. Compared to MBD2a, MBD2c showed similar molecule dynamics and enrichment in the heterochromatin compartments but did not influence the heterochromatin compartment size. In vitro, the purified MBD2c formed only irregular aggregates. Besides, the N-terminus formed only irregular aggregates in all conditions tested and showed the ability to recruit DNA. The MBD-TRD alone did not form any condensates but formed irregular aggregates in the presence of DNA. The C-terminus could form either irregular aggregates or spherical droplets depending on buffer conditions that are not influenced by DNA. Thus, polymer-polymer phase separation (PPPS) also plays a role in MBD2 function, especially for MBD2c. Consistently, high levels of MBD2-MBD-TRD and MBD2c did not influence the total occupancy of heterochromatin while the high levels of MBD2b promoted the spreading of the heterochromatin region. In conclusion, the N-terminus is responsible for protein-DNA interaction, the MBD-TRD is responsible for PPPS and heterochromatin localization, and the C-terminus is responsible for the LLPS. The three isoforms of MBD2 exhibit distinct functional properties due to a combination of the three regions. Thirdly, I demonstrated that MeCP2 alone could form liquid-like spherical droplets via self-interaction-induced LLPS. The fold enrichment of MeCP2 in the droplets in vitro and heterochromatin compartments in vivo was similar. MeCP2 LLPS could be promoted by various factors that somehow mimic the in vivo physiological conditions. DNA promoted the LLPS of MeCP2 in both DNA length and concentration-dependent manner by providing additional sites for multivalent weak protein-DNA interactions. Crowders promoted the MeCP2 LLPS by increasing the local protein concentration and enhancing the weak interactions via the “excluded volume” effect. The weak MeCP2-MeCP2 and MeCP2-DNA interactions were characterized by the emergence of a properly confined diffusion population in the droplets and heterochromatin compartments. Cytosine methylation restricted the size of MeCP2 condensates in vivo and in vitro with more confined overall mobility. The specific mC-DNA interaction contributed to the emergence of the static population with low to static diffusion in MeCP2 condensates in vivo and in vitro. The phase separation properties of MeCP2 were altered by the RTT-related nonsense mutations. In vivo, the MeCP2 promoted the heterochromatin compartment clustering, which was attenuated by RTT-related nonsense mutations. The phase separation properties and function of RTT-related nonsense mutations in heterochromatin compartment clustering are negatively correlated with the severity in RTT patients. RTT-related nonsense mutations influence the heterochromatin organization via impaired LLPS properties. These results provide new insights into the function and underlying mechanism of the MBD protein family in heterochromatin organization and thus contribute to our general understanding of phase separation in nuclei architecture.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

In den letzten zehn Jahren wurde die Phasentrennung als Mechanismus für die Bildung verschiedener subzellulärer Kompartimente vorgeschlagen, z. B. für die Kompartimentierung des Chromatins in eukaryotischen Zellkernen. Die Voraussetzungen für die Chromatinkompartimentierung wurden jedoch nicht gut charakterisiert und es wurden mehrere sich überschneidende Faktoren diskutiert. Ziel dieser Studie war es, einen Einblick in die Funktion und die zugrunde liegenden Mechanismen der Methyl-CpG-bindende Domäne (MBD)-Proteinfamilie bei der Chromatinorganisation zu gewinnen. Zunächst habe ich die Phasentrennungseigenschaften, Funktionen und Dynamik der Proteine der MBD-Familie in vitro und in vivo charakterisiert. Ich fand heraus, dass die Proteine der MBD-Familie unterschiedliche Phasentrennungseigenschaften und Funktionen bei der Organisation der Chromozentren haben. MBD1∆CxxC3, eine Isoform, der die unmethylierte CpG-Bindungsdomäne CxxC3 fehlt, bildete unregelmäßige Aggregate, während MBD2, MBD3, MBD4 und MeCP2 unter bestimmten Bedingungen in vitro flüssigkeitsähnliche sphärische Tröpfchen bildeten. In vivo kolokalisierten MBD1, MBD2, MBD4 und MeCP2 mit den Chromozentren und förderten dosisabhängig die Chromozentren Clusterbildung. MBD1∆CxxC3 und MBD3 hingegen hatten keinen Einfluss auf die Größe der Chromozentren. Außerdem zeigte sich, dass MBD1, MBD1∆CxxC3 und MBD4 die Rundheit der Chromozentren verringerten, während die anderen MBD Proteine keinen Einfluss darauf hatten. Die Messung der Dynamik des Molekülaustauschs der MBDs zwischen den Chromozentren und der Umgebung ergab, dass alle MBDs sehr dynamisch sind. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die MBD Proteine sich wie folgt in ihrer Fähigkeit zur Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) unterscheiden: MeCP2 > MBD2 > MBD3 > MBD4 ≥ MBD1∆CxxC3. Ihre Auswirkung auf die Größe der Chromozentren war in absteigender Reihenfolge: MeCP2 > MBD4 > MBD2 > MBD1∆CxxC3 ≈ MBD3. Der Einfluss der MBD Proteine auf die Rundheit der Chromozentren war: (MBD3 >) MeCP2 > MBD2 > MBD4 > MBD1∆CxxC3. Bei der Proteinmobilität unterschieden sich die MBD Proteine wie folgt: MeCP2 < MBD2 < MBD1∆CxxC3 < MBD4. Bei den immobilen Fraktionen waren: MeCP2 ≈ MBD2 > MBD4 ≈ MBD1∆CxxC3. Die Organisation der Chromozentren könnte also durch die von den Proteinen der MBD-Familie vermittelte Phasentrennung reguliert werden. MBD2 und MeCP2 zeigen in vitro die besten Eigenschaften bei der LLPS und beeinflussen die Chromozentrenstruktur am stärksten. Im zweiten Teil dieser Thesis habe ich die funktionellen Unterschiede der MBD2-Isoformen in vivo und in vitro aufgeklärt. MBD2 hat drei Isoformen: MBD2a, MBD2b und MBD2c. MBD2a umfasst den N-Terminus, die MBD-TRD und den C-Terminus, während MBD2b und MBD2c die konservierte MBD-TRD Domäne, aber entweder keinen N-Terminus oder keinen C-Terminus aufweisen. Alle MBD2 Isoformen zeigten die Fähigkeit zur Phasentrennung, jedoch mit unterschiedlichen Eigenschaften. MBD2b zeigte in vivo und in vitro insgesamt ähnliche, aber schwächere Funktionen als die Isoform MBD2a. MBD2b war weniger stark in Chromozentren angereichert, förderte die Clusterbildung von Chromozentren in geringerem Maße und zeigte einen schnelleren Molekülaustausch zwischen den Chromozentren und der Umgebung. Im Vergleich zu MBD2a zeigte MBD2c eine ähnliche Moleküldynamik und Anreicherung in den Chromozentren, hatte aber keinen Einfluss auf die Größe der Chromozentren. In vitro bildete MBD2c nur unregelmäßige Aggregate. Der N-Terminus allein formte irreguläre Aggregate in allen getesteten Konditionen und zeigte die Fähigkeit, DNA zu rekrutieren. Die MBD-TRD allein formte keine Kondensate, sondern unregelmäßige Aggregate in Gegenwart von DNA. Der C-Terminus konnte abhängig von den Pufferkonditionen und unabhängig von anwesender DNA entweder unregelmäßige Aggregate oder sphärische Tröpfchen formen. Somit spielt die Polymer-Polymer-Phasentrennung (PPPS) eine Rolle bei der Funktion von MBD2, vor allem von MBD2c. Übereinstimmend mit diesen Beobachtungen, hatten auch hohe Level MBD2-MBD-TRD und MBD2c keinen Einfluss auf die Heterochromatinbeschäftigung, während hohe Level MBD2b die Ausweitung der Heterochromatinregion förderten. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass der N-Terminus für die Protein-DNA-Interaktion, die MBD-TRD für die PPPS und die Chromozentren Lokalisation und der C-Terminus für die LLPS verantwortlich ist. Die drei Isoformen von MBD2 weisen unterschiedliche funktionelle Eigenschaften auf, die auf eine Kombination der drei Regionen zurückzuführen sind. Im dritten Kapitel habe ich gezeigt, dass MeCP2 allein flüssigkeitsähnliche sphärische Tröpfchen durch Selbstinteraktion-induzierte LLPS bilden kann. Die Anreicherung von MeCP2 in den Tröpfchen in vitro und den Chromozentren in vivo war ähnlich. Die LLPS von MeCP2 wurde durch verschiedene Faktoren gefördert, die die physiologischen Bedingungen in vivo nachahmen. Die Anwesenheit von DNA förderte die LLPS von MeCP2 sowohl in Abhängigkeit von der DNA-Länge als auch von der Konzentration, indem sie zusätzliche Stellen für multivalente schwache Protein-DNA-Wechselwirkungen bereitstellte. Crowder förderten die LLPS von MeCP2, indem sie die lokale Proteinkonzentration erhöhten und die schwachen Wechselwirkungen durch den "excluded volume"-Effekt verstärkten. Die MeCP2-MeCP2- und MeCP2-DNA-Wechselwirkungen wurden durch das Auftreten einer begrenzten Diffusionspopulation in den Tröpfchen und in den Chromozentren charakterisiert. Cytosin-Methylierung schränkte die Größe der MeCP2-Kondensate in vivo und in vitro ein und führte zu einer eingeschränkten Gesamtmobilität. Die spezifische mC-DNA-Wechselwirkung trug zum Entstehen der statischen Population mit geringer bis statischer Diffusion in MeCP2-Kondensaten in vivo und in vitro bei. RTT-bedingte Nonsense-Mutationen veränderten die Phasentrennungseigenschaften von MeCP2. In vivo förderte MeCP2 die Clusterbildung von Chromozentren, die durch RTT-bezogene Nonsense-Mutationen stark abgeschwächt wurde. Die Phasentrennungseigenschaften und die Funktion von RTT-bedingten Nonsense-Mutationen bei der Chromozentren Clusterbildung sind negativ mit dem Schweregrad der Erkrankung von RTT-Patienten korreliert. RTT-bedingte Nonsense-Mutationen beeinflussen die Chromozentrum Organisation durch beeinträchtigte LLPS-Eigenschaften.

Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die Funktion und den zugrundeliegenden Mechanismus der MBD-Proteinfamilie in der Heterochromatin Organisation und tragen somit zum Gesamtverständnis der Phasentrennung im Zellkern bei.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: ii, 160 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 17 Feb 2022 10:35
Last Modified: 17 Feb 2022 10:35
DOI: 10.26083/tuprints-00020494
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-204944
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Laube, Prof. Dr. Bodo
Date of oral examination: 27 January 2022
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/20494
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