Die beiden viralen Kaliumkanäle Kcv aus dem Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 und Kesv aus dem Ectocarpus siliculosus Virus 1 sind sich strukturell sehr ähnlich mit einem hohen Grad an Gemeinsamkeit in ihrer Aminosäuresequenz. Trotz dieser strukturellen Gemeinsamkeiten zeigen beide Kanäle, wenn sie in HEK293 Zellen exprimiert werden, eine grundverschiedene Sortierung: Kcv ist in der Plasmamembran lokalisiert, während Kesv sich in der inneren Mitochondrienmembran befindet. Vorausgegangene Studien haben gezeigt, dass die zweite Transmembrandomäne von Kesv ein Sortierungssignal enthält. Eine Verlängerung dieser Domäne um mehr als eine hydrophobe Aminosäure reichte aus, um die Sortierung von Kesv von den Mitochondrien in den sekretorischen Weg umzuleiten, bis letztendlich zur Plasmamembran. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage der molekularen Natur dieser Signalsequenz in der zweiten Transmembrandomäne. Um dies auf eine unvoreingenommene Art und Weise zu machen wurden randomisiert Mutanten der betreffenden Region in der zweiten Transmembrandomäne von Kesv mit Hilfe einer randomized site directed mutagenesis PCR hergestellt. In Kombination mit einem Hefekomplementationstest, bei dem nur Hefemutanten mit einem funktionalen Kaliumkanal in der Plasmamembran überleben, konnten zwei Kesv Mutanten gefunden werden. Diese Kesv Mutanten sind nicht länger in den Mitochondrien lokalisiert dafür aber in der Plasmamembran. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass eine Verlängerung der zweiten Transmembrandomäne von Kesv nicht zwingend notwendig ist, um eine Veränderung in der Kanalsortierung zu erzeugen. Bioinformatische Analysen des Aminosäureaustausches zeigten, dass vermutlich die Veränderung der Sortierung durch Aminosäuren verursacht wird, welche die lokale Energie für den Transfer der zweiten Transmembrandomäne in die Membran herabsetzen.

Um weiter die Sortierung der beiden Kesv Mutanten in die Plasmamembran zu bestätigen wurde die confocal laser scanning Mikroskopie verwendet. Für eine vertrauenswürdige Aussage war es nötig, eine bestehende Methode zur Isolierung der Plasmamembran aus Säugetierzellen zu optimieren, bei der ein Membranfleck auf poly-D-Lysin beschichteten Deckgläsern haftet. Nach der Entfernung des Zellkörpers mittels eines osmotischen Schocks und etlichen Waschschritten, welche einen flachen Membranfleck offenbaren, konnte das GFP Fluoreszenzsignal von Proteinen in diesen Membranflecken detektiert werden. Mit diesem Versuchsaufbau ist es möglich bekannte Plasmamembrankanäle wie Kat1 oder Kcv und die zwei Kesv Mutanten zu detektieren. Der Wildtyp vom Kesv, welcher in den Mitochondrien lokalisiert ist, kann in diesen Membranflecken nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung untermauern die Ergebnisse des Hefekomplementationstests, bei dem die Kesv Mutanten in der Plasmamembran lokalisiert sind. Diese Interpretation wird weiterhin durch Einzelmoleküluntersuchungen gestützt. Es zeigte sich, dass die Kombination der Isolierung von Membranflecken mit TIRF Mikroskopie sich gut eignet für hochaufgelöste Mikroskopie auf Einzelmolekülniveau. Das Signal zu Hintergrundrauschverhältnis ist sehr gering durch das geringe Anregungsvolumen des flachen Membranfleckens und des Fehlens von Signal des restlichen Zellkörpers. Auch mit dieser Technik war es möglich beide Kesv Mutanten und die Referenzkanäle Kat1 und Kcv in der Plasmamembran nachzuweisen. Die Mobilität der Proteine bestätigt, dass sie sich in der Membran befinden.