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Autor:	Lauber, Karin
Titel:	Schwefel-Mobilisierung bei Acidianus ambivalens
Dissertation:	TU Darmstadt, Fachbereich Biologie, 2006

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Abstract auf Deutsch:

Acidianus ambivalens ist ein hyperthermophiles Crenarchaeon der Ordnung Sulfolobales, welches aerob Schwefel oxidieren kann. Da das Schwefel-oxidierende Enzym im Cytoplasma lokalisiert ist, muss der Schwefel ausserhalb der Zelle aktiviert und fuer die im Cytoplasma stattfindenden Reaktionen in die Zelle transportiert werden. Die Schwefelmobilisierung wurde in dieser Arbeit naeher analysiert. Zunaechst wurde das Wachstum mit alternativen Substraten, Tetrathionat und Thiosulfat, untersucht, die ein wichtiges Zwischenprodukt der Schwefelmobilisierung darstellen koennten. Die Zellen wuchsen nicht mit Thiosulfat wohl aber mit Tetrathionat. Hohe Konzentrationen an Trithionat wurden beim Wachstum mit Tetrathionat gebildet, nicht aber beim Wachstum mit Schwefel. Weiterhin bildeten die Zellen signifikante Mengen an Schwefel, der hydrophiler als elementarer Schwefel war. Tetrathionat wurde von Kulturen bei Wachstum mit Mischsubstraten bevorzugt abgebaut und Tetrathionat-adaptierte Zellen wuchsen nur schlecht mit Schwefel. Tetrathionat kam somit nicht als Intermediat des aeroben Schwefelstoffwechsels in Frage. In Kulturueberstaenden und Schwefelsediment nach Kulturwachstum wurde nach sekretierten Proteine gesucht. Spezifisch nur im Schwefelsediment nach aeroben Wachstum mit Schwefel wurde ein Protein gefunden, welches Schwefel-Binde-Protein (SBP) genannt wurde. Das SBP war stark glykosyliert und hatte eine braeunliche Faerbung in Loesung, welche mit einer hohen Eisenkonzentration einerging. Der Edmann-Abbau ergab eine Mischsequenz, welche mit einem Serin startet. Sie zeigte eine Uebereinstimmung mit einem Fragment, genannt contig 275 der internen partiellen Genomsequenz-Datenbank von Acidianus ambivalens. Die abgeleitete Aminosaeuresequenz war 310 Aminosaeuren lang (? 34,1 kDa) und zeigte mehrere vorhergesagte Glykosylierungsstellen. Vier Methion-Codons in Abstaenden von 4, 8, 30 und 41 Aminosaeuren wurden stromauf des sbp-Gens identifiziert. Eine Primerextensions-Analyse zeigte, dass der Transkriptionsstartpunkt 9 nt vor dem zweiten Methionin lag. Vor dem Transkriptionsstart lagen im archaea-typischen Abstand eine TATA-Box und ein BRE. Die 30 Aminosaeuren stromauf vom Protein hatten die typischen Zusammensetzung eines sekretorischen Signalpeptids, mit N-Domaene mit zwei Lysinen als Sequenzmotiv und einer hydrophoben H-Domaene vorhergesagter alpha-Helix. Es wurde versucht die sbp-Region in E. coli ueberzuexprimieren und das Protein mittels Saeulenchromatographie aufzureinigen aber mit negativen Resultaten. Auch Western-Analysen gaben keine Ergebnisse. Eine Southern-Hybridisierung des Genoms von Acidianus ambivalens ergab drei unabhaengige Banden, was eine dreifache Kopienzahl des sbp im Genom vermuten laesst. Northern-Hybridisierungen ergaben, dass die sbp-RNA während der kompletten Wachstumsphase der Zellen beim aeroben Schwefelstoffwechsel gebildet wird. Die RNA war viermal laenger als erwartet. Dies deutet darauf hin, dass das sbp in einem Operon mit mehreren Gene noch nicht identifizierten Genen liegt.

Abstract auf Englisch:

Acidianus ambivalens is a hyperthermophilic Crenarchaeon from the order Sulfolobales, which can oxidize sulfur aerobically. The sulfur-oxidizing enzyme is localized in the cytoplasm. Thus sulfur must be activated outside of the cell and transported inside. This sulfur mobilization was analyzed in this work. Growth with the alternative substrates tetrathionate and thiosulfate was analyzed, which could be important intermediates of sulfur mobilization. The cells did not grow with thiosulfate but with tetrathionate. A high concentration of trithionate accumulated transiently during growth with tetrathionate but not with sulfur. Sulfur precipitated during growth, which was more hydrophilic in appearance than elemental sulfur. Tetrathionate was preferred in cultures with mixed substrates. Tetrathionate-adapted cells did not grow well with sulfur. It was concluded that tetrathionate was not an intermediate of the aerobic sulfur oxidation pathway. Culture supernatants and spent sulfur pellets were analyzed for the presence of proteins. A single protein termed sulfur-binding protein (SBP) was isolated from the sulfur pellets of cultures grown aerobically. The SBP was highly glycosylated. It had a brown color in solution, which correlated with a high concentration of iron. Edman degradation gave a mixed sequence starting with a serine residue that showed one match with a fragment termed contig275 in the internal partial genome sequence database from Acidianus ambivalens. The deduced amino acid sequence protein was 310 amino acids in length (? 34,1 kDa). It showed multiple predicted glycosylated sites. Four methionine codons in distances of 4, 8, 30 and 41 amino acids were identified upstream of the sbp gene. Primer extension analysis showed that the transcriptional start point was 9 nt upstream of the second Met codon. A TATA box and a BR element were present in a distance typical for Archaea upstream of the start point. The 30 aa upstream of the protein start had the typical composition of a secretory leader peptide consisting of an N-domain with two lysine residues and a hydrophobic H-domain with a predicted alpha helix as sequence motifs. It was tried to overexpress the sbp gene in E. coli and to purify the protein with column chromatography but with negative results. Western analysis also gave no result. Southern hybridization of genomic A. ambivalens DNA gave three independent bands, so that the sbp gene is eventually present in three copy. Northern hybridization showed that the sbp RNA was expressed during the complete growth cycle during aerobic sulfur metabolism. The size of the mRNA was four times longer that the sbp gene pointing to the presence of an operon with other yet unidentified genes.

Dokument aufgenommen :	2006-05-08
URL:	http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000689