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Autor:	Albert, Markus
Titel:	Studien zur Interaktion des pflanzlichen Parasiten Cuscuta reflexa mit dem inkompatiblen Wirt Lycopersicon esculentum
Dissertation:	TU Darmstadt, Fachbereich Biologie, 2005

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Abstract auf Deutsch:

Der pflanzliche Holoparasit Cuscuta reflexa wächst ohne Wurzeln und Blätter windenartig an den Sprossen von anderen Pflanzen. Mit Hilfe von Haustorien dringt Cuscuta in das Gewebe der Wirtspflanzen ein und entzieht ihnen Nährstoffe, Assimilate und Wasser. Tomate stellt eine der wenigen Pflanzen dar, die für eine Cuscuta-Infektion resistent ist. Durch die Bildung eines sekundären Abschlussgewebes im direkten Infektionsbereich schützt sie sich vor einem Eindringen der parasitischen Haustorien. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das sekundäre Abschlussgewebe der Tomate aus Wundsuberin besteht. Ältere Tomatenpflanzen waren meist nicht mehr in der Lage ein solches Schutzgewebe zu produzieren und sind folgedessen für eine Cuscuta-Infektion kompatibel. Aufgrund eines möglichen Zusammenhanges einer Abwehrreaktion gegen Cuscuta und einer allgemeinen Wundreaktion der Tomate, wurden Signale wie Jasmonsäure (JA), Salizylsäure (SA) und Kalzium, die während einer Wundreaktion auftreten, näher untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass der JA-Gehalt in infizierten Tomatenpflanzen um das fünf- bis sechsfache zunimmt. Versuche mit Pflanzen, die einen konstitutiv stark verminderten SA- bzw. JA-Gehalt aufweisen, offenbaren jedoch dasselbe Abwehrverhalten gegenüber Cuscuta wie infizierte Kontrollpflanzen. Die Analyse von Aequorin-exprimierenden Tomaten- und Tabakpflanzen ergab, dass Ca2+-Signale ca. 12 – 16 Stunden nach Ansetzen von Cuscuta in einem Zeitraum von mehreren Stunden in Wirtspflanzen erschienen. An Hand eines Tests mit Blattscheiben von Aequorin-exprimierenden Tomatenpflanzen konnte belegt werden, dass nur Protein-Extrakte aus Cuscuta-Haustorien Ca2+-Signale auslösen. Ein neu identifiziertes Arabinogalactan Protein (attAGP) der Tomate wurde molekularbiologisch charakterisiert und seine Funktion während der Abwehr gegenüber Cuscuta ermittelt. Zur Untersuchung der subzellulären Lokalisation wurden Zellen einer Zwiebelschuppen-Epidermis transient mit einem attAGP-mGFP4-cDNA-Konstrukt transformiert. Mit Hilfe eines „Confokalen Laser Scanning Mikroskops“ konnte das attAGP-mGFP4 Fusionsprotein ausschließlich in der Plasmamembran lokalisiert werden. Nach dem Klonieren und der Fusion des attAGP-Promotors mit einem Reportergen konnte gezeigt werden, dass das attAGP-Gen ca. 24 Stunden nach Ansetzen von Cuscuta direkt an der Infektionsstelle aktiv ist, was mit Ergebnissen einer Northernblot-Analyse übereinstimmt. Zur Funktionsanalyse von attAGP wurde dessen mRNA-Gehalt in Tomatenpflanzen transient mittels „Virus Induziertem Gen Silencing“ (VIGS) vermindert. Nach dem Messen der parasitären Anheftungskraft war ein direkter Zusammenhang zwischen attAGP-mRNA-Gehalt und dem Anheftungsverhalten von Cuscuta an der Tomate offensichtlich. Je mehr attAGP-mRNA an der Cuscuta-Ansatzstelle vorhanden ist, desto größer ist die Anheftungskraft von Cuscuta. attAGP stellt ein Anheftungsprotein dar. Von Cuscuta reflexa wurde eine cDNA-Bibliothek angelegt, und diese differentiell nach Sequenzen durchmustert, deren Gene während der Entwicklung von Haustorien induziert sind. Neben mehreren noch unbekannten Sequenzen wurden cDNAs identifiziert, deren Proteine an Vorgängen wie genetische Mobilität, Signaltransduktion oder der Lyse von Zellwänden und Proteinen beteiligt sind.

Abstract auf Englisch:

Dodder or Cuscutaceae are holoparasitic plants subsisting on other dicotyledonous plants. Cuscuta reflexa lacks roots or leaves and is absolutely dependent on a compatible host plant. The infection process initiates by adherence of Cuscuta prehaustoria to the host surface, followed by penetration of haustoria. In case of a successful infection, these organs connect the parasite’s vascular tissue to that of the host. Tomato represents one of the few plants with an active resistance reaction. This is indicated by formation of a protective tissue and hypersensitive reaction (HR) directly at the infection site. Here evidence is provided, that the protective tomato-tissue consists of compounds which are characteristic for wound suberin. Older tomato plants are not able to produce such a protective tissue and consequently are compatible for a Cuscuta-infection. It is also shown that the phytohormones Salicylic acid (SA) and Jasmonic acid (JA) are not responsible for a successful resistance reaction of tomato, although an increase of JA-level could be observed in Cuscuta-infected tomato plants. This was shown with the help of transgenic plants which have a constitutive low SA- or JA-level. Using transgenic aequorin-expressing plants it was demonstrated that the contact of prehaustoria to the host plant causes local Calcium-fluxes in compatible tobacco and in incompatible tomato plants approximately 12 – 16 h after parasite onset. A test with aequorin-expressing tomato leaf discs verified that proteins of Cuscuta elicit such signals. Moreover, infection with the parasite induces expression of a new Arabinogalactan protein (AGP), attAGP (att = attachment), in the incompatible host tomato at the site of dodder attack. Northernblot experiments show that attAGP-expression is increased one day post infection. attAGP-promoter was cloned and used to control a Glucuronidase reporter gene. After transformation to tomato plants, promoter activity was only detected at Cuscuta attachment sites 2 – 3 days post parasite onset. After construction of an attAGP-mGFP4-cDNA and transient transformation of onion scale epidermis, attAGP is localized in the plasmamembrane. Using attAGP targeted virus induced gene silencing a direct correlation between attAGP expression level and the attachment-force of the parasite to its host was found. The attachment force of Cuscuta to tomato was quantified with a sprig scale and it was proved that attachment force decreases if attAGP-mRNA-content is low. Combined, our results suggest that Cuscuta infection induces a signal in the host, probably involving Ca2+-fluxes, leading to the specific induction of the tomato attAGP gene, which promotes the parasite’s adherence. A cDNA-library of total mRNA of Cuscuta prehaustoria and haustoria was constructed. This library was differentially screened with a micro-array technique for genes which are specifically induced during Cuscuta haustoria development and the infection process. Besides others, sequences were found which participate in cell wall loosening, genetic mobility and signal transduction.

Dokument aufgenommen :	2005-11-23
URL:	http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000629