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Autor:	Rubant, Simone
Titel:	Molekulare Wirkmechanismen rekombinant hergestellter Chemokinrezeptor-Antagonisten auf entzündungsrelevante Immunzellen
Dissertation:	TU Darmstadt, Fachbereich Biologie, 2005

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Abstract auf Deutsch:

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der nephritogene T-Helfer-1-Zellklon, IF12, hinsichtlich seines Chemokinrezeptorprofils auf RNA- und Proteinebene charakterisiert, um ein definiertes Zellmodell zu besitzen, welches für die anschließende Austestung von drei Chemokinrezeptor-Antagonisten geeignet ist. Dazu wurde die RNA von Mitogen-aktivierten und unstimulierten Th1-Zellen gewonnen und das Chemokinrezeptorprofil mittels RT-PCR und cDNA-Array untersucht. Das Ergebnis dieser Experimente zeigte eine konstitutive Expression der Rezeptoren CCR1, CCR2, CCR5-7, CXCR3, CXCR4 auf RNA-Ebene. Durch die Aktivierung der Th1 Zellen mit ConA wurde eine signifikant gesteigerte Expression von den Rezeptoren CCR4, CCR6 und CCR7 und eine deutliche Reduktion der Expression von CCR5 und CXCR3 induziert. Auf Proteinebene konnte die Oberflächenexpression der für die Antagonistenstudien wichtigen Chemokinrezeptoren CCR2, CCR5 und CXCR3 nachgewiesen werden. Hinsichtlich der gängigen Definition von T-Zell-Subtypen konnte der Th1IF12-Zellklon als central memory oder Gedächtnis-Zelltyp eingestuft werden (Sallusto et al., 1998). Dieser Zellklon wurde für die weiteren experimentellen Versuche verwendet. Weiterhin wurden drei Chemokinrezeptor-Antagonisten, eine N-terminal deletierte Form des Chemokins MCP-1/CCL2, MCP-1(1-8)del, virales MIP-II und eine N-terminal deletierte Variante des Chemokins I-TAC/CXCL11, I-TAC(1-3)del, in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert, durch Heparin-Affinitätschromatographie aufgereinigt und deren inhibitorische Wirkung auf die Th1-Zellen untersucht. Durch die Expression in Pichia pastoris konnten drei funktionell bioaktive Chemokinrezeptor-Antagonisten generiert wurden, die in der Lage waren, die spezifische Liganden-induzierte Th1-Chemotaxis Rezeptor-spezifisch zu inhibieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Kombination von zwei Chemokinen (MCP-1/CCL2 und IP-10/CXCL10 oder I-TAC/CXCL11) die Th1-Migration signifikant steigerte und, dass eine deutliche Inhibition dieser gesteigerten Chemotaxis durch simultanen Einsatz von MCP-1(1-8)del und I-TAC(1-3)del erzielt wurde. Bei der Untersuchung zur Signalweiterleitung von CXCR3 wurde beobachtet, dass weder Pertussis-Toxin (PTX) noch AG490 einen Einfluss auf die I-TAC-induzierte Internalisierung hatte. Die I-TAC-vermittelte Chemotaxis konnte, wie erwartet durch PTX blockiert werden, wodurch die Signalvermittlung über Gi bestätigt wurde. AG490 führte überraschenderweise zu einer Steigerung der I-TAC-induzierten Chemotaxis. Die Effekte von PTX und AG490 wurden anschließend auf die I-TAC-induzierte Kalzium-Mobilisierung getestet und ergaben eine Blockierung des Kalziumsignals nach PTX-Behandlung, sowie ein verlängertes Kalziumsignal nach AG490-Behandlung. Beim Einsatz des Chemokinrezeptor-Antagonisten I-TAC(1-3)del im in vivo-Modell zur Untersuchung der Leukozytenwanderung im Mausohr (Intravitalmikroskopie, IVM) konnte beobachtet werden, dass ein durch IP-10/CXCL10-Stimulierung gesteigertes Rollverhalten der Th1-Zellen am Venenendothel durch anschließende Antagonisten-Behandlung signifikant inhibiert wurde. Zusammenfassend zeigt dies, dass die Expression der drei rekombinanten Chemokinrezeptor-Antagonisten, MCP-1(1-8)del, vMIP-II und I-TAC(1-3)del, in Pichia pastoris zu potenten und funktionell bioaktiven Proteinen führte, die ein viel versprechendes Werkzeug für die Behandlung Th1-vermittelter Entzündungskrankheiten darstellen.

Abstract auf Englisch:

In this thesis the chemokine receptor profile of a nephritogenic T helper-1 cell clone was characterized on RNA and protein level to generate a specific cell model for the investigation of three chemokine receptor antagonists. Therefore RNA of mitogen-activated and unstimulated Th1 cells was isolated and the chemokine receptor profile was determined using RT-PCR and cDNA-Array. The results of these experiments showed a constitutive expression of the receptors CCR1, CCR2, CCR5-7, CXCR3 and CXCR4 on RNA level. Activation of the Th1 cells with ConA significantly enhanced the expression of the receptors CCR4, CCR6 and CCR7, and reduced the expression of CCR2, CCR5 and CXCR3. The surface expression of the receptors CCR2, CCR5 and CXCR3, which were important for the antagonist studies, was determined on protein level. According to the common definition of T cell subtypes the Th1IF12 cell clone could be determined as central memory T cell (Sallusto et al., 1998). This cell type was used for further experiments. Additionally, three chemokine receptor antagonists, a N-terminal deleted form of MCP-1/CXCL2, MCP-1(1-8)del, viral MIP-II and a N-terminally deleted variant of I-TAC/CXCL11, I-TAC(1-3)del, were expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, purified using heparin affinity chromatography and analysed regarding their inhibitory effects. The expression in Pichia pastoris resulted in three functionally bioactive chemokine receptor antagonists, which specifically inhibited the ligand induced Th1-migration. It was shown, that combination of two chemokines (MCP-1/CCL2 and IP-10/CXCL10 or I-TAC/CXCL11) significantly increased the migration of Th1 cells and, that this increased migration was strongly inhibited by the combination of the antagonists MCP-1(1-8)del and I-TAC(1-3)del. Investigating the signalling through CXCR3 it was observed that neither pertussis toxin (PTX) nor AG490 had any effect on I-TAC-induced CXCR3-internalization. I-TAC-induced chemotaxis, as expected, was totally blocked by PTX, indicating a signalling via Gi. AG490 surprisingly enhanced the I-TAC-induced chemotaxis. Furthermore, the effects of PTX and AG490 on I-TAC-induced calcium-mobilization were analysed and showed an inhibition of calcium signalling after treatment with PTX, whereas AG490 resulted in a sustained calcium signal. The use of the chemokine receptor antagonists I-TAC(1-3)del in an in vivo-method enabling the investigation of leukocyte recruitment in a mouse ear (intravital microscopy, IVM) showed, that IP-10/CXCL10 stimulation resulted in an increased rolling of Th1 cells and that this increased rolling was reduced by using the specific antagonist. In summary these data implicate that the expression of the recombinant chemokine receptor antagonist MCP-1(1-8)del, vMIP-II and I-TAC(1-3)del in Pichia pastoris lead to potent and functional active proteins, which are promising tools for the treatment of Th1-driven inflammatory diseases.

Dokument aufgenommen :	2005-06-01
URL:	http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000564