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Autor: Aubert-Jürgens, Ana
Titel:STAT3 inhibitors for cancer treatment
Dissertation:TU Darmstadt, Fachbereich Biologie, 2005

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DateinameInhaltFormatGröße (Byte) Kommentar
aubert-jurgens-part1.pdf Part 1: Summary, Introduction, Aims, Materials and Methods 1819983
aubert-jurgens-part2.pdf Part 2: Results and Discussion 4825836

Abstract auf Deutsch:


In der voliegenden Arbeit wurde dir Rolle des Transkiptionsfaktors “Signal Tansducer and Activator of Transcription 3” (STAT3) in der humanen Onkogenese studiert. Die stabile Transfektion von v-src, Kinase die STAT3 direkt phosphorylieren kann, in immortalisierte, humane Brustepithelzellen, MCF10A Zellen, hat zu einer konstitutiven Akitvierung von STAT3 in diesen Zellen gefûhrt. MCF10A-v-Src Zellen proliferieren und untergehen nicht der Apoptose in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, und sind auch substratunabhängig für ihr Wachstum. Diese Zellen sind jedoch wahrscheinlich nicht vollkommen transformiert, da sie keine Tumore in Nacktmäusen bilden. In dieser Arbeit wurde auch gezeigt, dass die Hemmung von STAT3 in 293 Zellen die Proliferation beeinträchtigt und programmierten Zelltod induziert. Diese Ergebnisse wurden in zwei verschiedenen experimentellen Ansätzen gezeigt: in stabile 293 Transfektanten mit Tetrazyklin-induzierbares, dominant-negatives (DN) STAT3, und in wildtyp 293 Zellen, durch transiente Expression von STAT3 RNAi. Ein zweites Projekt war das rationale Design von STAT3 Inhibitoren. Nach einer detaillierten Analyse der Krystallstruktur von STAT3 wurde die SH2–Domäne als bester Angriffspunkt gewählt. Es zeigte sich, dass eine Limitation dieser Domäne die hohe Homologie zu den restlichen humanen STATs war. Eine bedeutende Homologie zur Phosphotyrosin-Bindungstasche von anderen SH2-enthaltenden Proteinen, wie z. B. Src, wurde präzise charakterisiert. Um die Affinität von Inhibitoren der STAT3-SH2-Domäne zu messen wurde ein mittel-durchsatzfähiger STAT3 in vitro Dimerisierungstest etabliert. Die Rolle der verschiedenen Aminosäuren der Phosphotyrosinsequenz von STAT3 (AAPY*LKTKF) wurden durch Peptiden unterschiedlicher Länge getestet. Y*L ergab sich als Minimalsequenz der Dimerisierungsinhibition, und PY*LKT zeigte die höchste Affinität. Diese Ergebnisse stimmen mit den oben genannten Beobachtungen der STAT3-Krystallstruktur überein, die gezeigt haben, dass neben dem Phosphotyrosin (i.e. Aminosäure 0), die Reste + 1 and + 3 die wichtigste Rolle in der Dimerisierungsinteraktion spielen. Die Relevanz von Position + 1 wurde durch die Alaninmutante Y*AKT bestätigt, die im Vergleich zu Peptid Y*LKT eine Affinitätsverringerung von mehr als zehnfach zeigte. Ein nicht peptidisches, kleines Molekül, das im “virtual ligand screening” (VLS) als potentieller STAT3-Dimerisierungsinhibitor identifiziert wurde, zeigte auch Hemmung in vitro. Dieser ist der erste beschriebene STAT3 Inhibitor, und könnte den Struktur-Aktivitäts-Studien dienen, um potentere und bioverfügbare Molelüle zu finden.

Abstract auf Englisch:

The critical role of the activation of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in the growth and survival of human tumor cells was one of the subjects of this thesis. It was found that the stable incorporation of v-Src into MCF10A cells, a human immortalized breast epithelial cell line, induced constitutive phosphorylation of STAT3 in these cells. MCF10A-v-Src cells displayed growth factor independence for proliferation and survival, and anchorage independence. However, these cells did not form tumors in nude mice, indicating that they were not fully transformed. Furthermore, inhibition of activated STAT3 in 293 cells decreased growth and induced apoptosis in these cells. The same results were obtained in 293 cells stably transfected with tetracycline-inducible dominant negative (DN) STAT3, and in 293 cells transiently expressing STAT3 RNAi. Since STAT3 promises to be a good target for cancer treatment, it was attempted to develop inhibitors through rational design. Within STAT3, the SH2-domain was chosen as being the best target site. One limitation of this site turned out to be its similarity to family members in this region, and even to other SH2-domain containing proteins, such as Src, all of which present a highly conserved pocket to bind phosphotyrosines. A medium-throughput assay to measure STAT3 dimerization in vitro was established to determine the affinity of compounds to the SH2-domain of STAT3. Peptides of different length derived from the phosphotyrosine-containing motif of STAT3 (AAPY*LKTKF) were tested in the assay. Y*L was found to be the minimal sequence to block dimerization, and out of the tested peptides, PY*LKT had the highest affinity. This was consistent with the observations made on the crystal structure of STAT3, which indicated that besides the phosphotyrosine-binding site, position + 1 and + 3 contributed most importantly to binding. The relevance of position + 1 was further confirmed by substitution of Leu+ 1 by Ala in the peptide Y*LKT, which decreased the affinity more than ten times. Finally, one non-peptidic small molecule inhibitor identified by virtual ligand screening (VLS) proved to be a STAT3 dimerization inhibitor in vitro. This is the first small molecule inhibitor of STAT3 identified so far, and might serve to study structure activity relationships (SAR) to optimize the structure and find more potent and bioavailable compounds.
Dokument aufgenommen :2005-05-31
URL:http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000563