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EPDA - Elektronische Publikationen Darmstadt

Autor:	Funk, Anneke
Titel:	Identifizierung und funktionelle Modulation essentieller zellulärer Komponenten für die Propagation von Hepatitis B-Viren
Dissertation:	TU Darmstadt, Fachbereich Biologie, 2004

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Dateiname	Inhalt	Größe (Byte)
AF_Diss1.pdf	Titel, Einleitung, ErgebnisseI	4861282
AF_Diss2.pdf	ErgebnisseII	4637662
AF_Diss3.pdf	ErgebnnisseIII, Material, Methoden	3771931

Abstract auf Deutsch:

Während die späten Schritte des hepadnaviralen Replikationszyklus inzwischen recht detailliert charakterisiert sind, besteht immer noch große Unklarheit über die frühen Schritte, d.h. die infektiöse Aufnahme der Hepatitis B-Viren in ihre Wirtszellen. Die frühen Schritte der Infektion beinhalten das Erkennen des Rezeptors, die Bindung an die Zellen sowie die Internalisierung und der intrazelluläre Transport der Viren. Der koordinierte Ablauf dieser Schritte im Zusammenspiel mit den weitgehend unbekannten zellulären Komponenten entscheidet nicht nur über das Zustandekommen einer produktiven Infektion, sondern bestimmt maßgeblich auch die Wirts- und Leberspezifität der Hepatitis B-Viren. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die initialen Schritte der hepadnaviralen Infektion am aviären Enten-Hepatitis B-Virus (DHBV)-Modellsystem zu charakterisieren. Zentral hierfür war die Etablierung eines sensitiven Nachweissystems, welches erstmals die quantitative Analyse der viralen Bindung und Aufnahme erlaubt. Es konnte gezeigt werden, dass die Zahl der spezifischen Bindungsstellen für virale Partikel limitiert und mit etwa 10(4) pro Zelle relativ niedrig ist. Subvirale Partikel, die kein Genom enthalten und die kompletten Virionen in großem Überschuss begleiten, verhielten sich in der Bindungskinetik und -effizienz ähnlich den Virionen. Obwohl nach eigenen Experimenten nur relativ wenige virale Partikel an die Zellen binden, wurden alle innerhalb von 3 h in die Zellen aufgenommen. Die anschließende Reise der Viren zum Zellkern dauerte im Vergleich zu anderen Viren relativ lange (etwa 15 h) und hing stark von intakten und dynamischen Mikrotubuli (MT), jedoch nicht vom Aktinskelett ab. Bemerkenswerterweise wurden die MT während dieser zytoplasmatischen Passage der Partikel nur zu ganz bestimmten Zeitpunkten gebraucht. Das Fehlen der cccDNA zusammen mit der Instabilität der Viren in MT-inaktivierten Zellen deutet darauf hin, dass die Mehrzahl der aufgenommenen viralen Partikel degradiert wird. Untersuchungen zur möglichen Rolle des so genannten Zellpermeabilitäts-vermittelnden Motivs (TLM) während der viralen Aufnahme ergaben, dass DHBV zwei distinkte TLM-Motive in der preS-Region des L-Proteins besitzt und deren genetische Zerstörung nicht mit der Replikationskompetenz der korrespondierenden Genome interferiert. Die anschließende Analyse der Infektionstüchtigkeit der Nachkommensviren in primären Hepatozyten ergab, dass im Gegensatz zu Wildtypviren alle TLM-defizienten Viren nicht infektiös sind. Diese Befunde zeigen erstmals, dass die TLMs eine essentielle Rolle nach der viralen Bindung und Aufnahme spielen. Untersuchungen zur Rolle von Cholesterin sowohl in hepadnaviralen als auch zellulären Membranen für die Virusaufnahme in Hepatozyten ergaben, dass die Depletion von Cholesterin aus der viralen Membran zu einer höheren Dichte der Virionen und einem Verlust der Infektiosität führt und diese Effekte durch eine Cholesterinrepletion nicht wieder rückgängig gemacht werden konnten. Wie durch das Profil einer proteolytischen Spaltung der viralen Oberflächenproteine gezeigt werden konnte, hatten diese dramatischen Veränderungen der physikalischen Eigenschaften der viralen Partikel keine nachweisbaren Änderungen der Virusintegrität oder Oberflächenprotein-Topologie zur Folge. Auch die virale Bindung und Aufnahme in Hepatozyten war nach Cholesterindepletion nicht signifikant eingeschränkt. Im Gegensatz zur viralen Membran zeigte die Depletion des Cholesterins der Hepatozyten vor der Inokulation, wodurch die lipid rafts der Plasmamembran zerstört werden, keine Interferenz mit der Infektion, sondern schien sie sogar zu verstärken. Diese Ergebnisse waren konsistent mit dem Befund, dass virale Partikel nicht mit Detergenz-unlöslichen Membrandomänen assoziiert nachgewiesen werden konnten. Zusammen belegen diese Daten, dass das Cholesterin der viralen Membran nach Bindung und Aufnahme der viralen Partikel für einen frühen Schritt im viralen Lebenszyklus essentiell ist. Außerdem deuten sie stark darauf hin, dass Hepadnaviren für die Aufnahme in die Wirtzelle nicht primär lipid rafts nutzen. Untersuchungen zur Zell-Zell-Übertragung von Hepadnaviren ergaben, dass sich Hepatitis B-Viren hauptsächlich durch sekretierte, extrazelluläre Nachkommensviren ausbreiten. Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie-Analysen zeigten eine intrazelluläre Akkumulation viraler Partikel in zellulären Vesikeln, die präferentiell nahe der basolateralen Membran der infizierten Hepatozyten zu finden waren. Zusammenfassend zeigen diese Befunde einen polarisierten Egress der viralen Partikel in interzelluläre Kompartimente, die eine freie Diffusion einschränken und die präferentielle Infektion benachbarter Hepatozyten bedingen könnten. Zusammen zeigen diese Daten zum ersten Mal eine Reihe und die Kinetik von Schritten, die für die Aufnahme von Hepatitis B-Viren in Hepatozyten essentiell sind und so zuvor bei keinem anderen Virus gezeigt wurden.

Abstract auf Englisch:

While the late steps of the hepadnaviral replication are characterized in detail, the early steps including infectious uptake of hepatitis B viruses into the host cell remain largely unknown. The early steps are recognition of the receptor, binding to the cells as well as internalization and intracellular transport. This coordinated interplay with mainly unknown cellular components do not only determine the establishment of a productive infection, but also the host and species tropism of hepatitis B viruses. The goal of this work was to characterize the initial steps of hepadnaviral infection in the avian duck hepatitis B virus (DHBV) model system. To reach this goal, a sensitive detection system was established which first allowed the quantitative analysis of viral binding and entry. It was shown that the number of specific binding sites for viral particles is limited and with about 10(4) per cell relatively low. Subviral particles which lack the genome and are secreted in large excess compared to virions showed similar binding kinetics and efficiency. Besides the low number of binding, all viral particles were internalized within 3 h. The following itinerary to the nucleus takes relatively long (about 15 h) and was highly dependent on intact and dynamic microtubules, but not actin. Interestingly, microtubules were only needed during specific periods of cytoplasmic transport. The lack of cccDNA together with the instability of viruses in microtubule-inactivated cells suggests that the majority of viral particles is degraded after entry. Investigation of the role of translocation motifs during viral entry showed that DHBV harbors two distict motifs in the preS region of the L protein which are not needed during morphogenesis. The infectivity analysis of viruses in which the translocation motifs were inactivated showed that all deficient viruses were not infectious. These findings show for the first time that translocation motifs play an essential role after viral binding and entry. Investigations of the role of cholesterol in the hepadnaviral as well as cellular membrane showed that depletion of cholesterol from the viral membrane resulted in a higher density of the virions and loss of infectivity. This effect was not reversible upon replenishment with cholesterol. The profile of proteolytic cleavage of the viral particles showed no detectable differences in virus integrity or surface protein topology. Viral binding and entry were also not significantly affected. In contrast to the viral membrane, cholesterol depletion of the host cell membrane prior to inoculation to destroy lipid rafts did not result in reduced infection. It even seemed to be enhanced. These results were consistent with the finding that viral particles were not found associated with detergent insoluble membrane domains. Taken together, these data show that viral membrane cholesterol is essential for an early step in the viral life cycle after binding and entry. They also suggest that hepadnaviruses do not primarily use lipid rafts during entry. Investigations of the cell to cell spread of hepadnaviruses showed that the viruses spread mainly through secreted, extracellular virions. Electron and fluorescence microscopical analysis showed an intracellular accumulation of viral particles in cellular vesicles that were preferentially found near the basolateral membrane of the infected hepatocyte. Taken together, these data show a polarized egress of viral particles in intercellular compartments which restrict free dissufion and may lead to preferential infection of neighbouring hepatocytes. The data show for the first time a series and the kinetics of steps essential for the entry of hepatitis B viruses in hepatocytes which have not been shown for any other virus before.

Dokument aufgenommen :	2004-12-13
URL:	http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000508