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Autor: Meckel, Tobias
Titel:Endocytosis against the high turgor of guard cells
Dissertation:TU Darmstadt, Fachbereich Biologie, 2004

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meckel_tobias.pdf (5105752 Byte)

Abstract auf Deutsch:


Stomata, befinden sich in der Epidermis photosynthetisch aktiver Pflanzenorgane. Sie bestehen aus zwei Schließzellen, die eine Pore bilden, welche den Austausch von CO2 und Wasser mit der Umwelt gestattet. Dieser Austausch wird reguliert, indem die Schließzellen aktiv ihr Volumen und damit unweigerlich auch ihre Oberfläche ändern, um die Appertur der Pore zu variieren. Die Änderungen erfolgen durch die Aufnahme oder Abgabe von K+ über K+-selektive Kanäle, was den Ein- bzw. Ausstrom von Wasser zur Folge hat. Die Quantifizierung dieser osmotisch angetriebenen Änderung anhand der 3D Rekonstruktion der Schließzellen von Vicia faba L. ergab bei einer Apperturdifferenz von 50 % eine Änderung des Volumens um 25 % und der Oberfläche um 15 %. Da die Dehnbarkeit von biologischen Membranen auf etwa 2 % beschränkt ist, erfordern die Oberflächenänderungen während der Bewegung der Stomata einen Ein- bzw. Ausbau von Membran an der Plasmamembran (PM). Allerdings wurde Endocytose in Pflanzen aufgrund energetischer Überlegungen oft in Frage gestellt, da ein hoher Turgor die Vesikelbildung an der PM erschwert. Um diesen Prozess in den extrem turgeszenten Schließzellen zu untersuchen, wurde die Dynamik der PM mit Hilfe der Konfokalmikroskopie analysiert. Dabei wurde der Verbleib von membran-affinen Styryl-Farbstoffen (FM4-64, FM2-10, FM1-43), sowie der fluidaffine Farbbstoff Alexa 488 Hydrazid unter natürlichen und konstanten osmotischen Verhältnissen verfolgt. Als weitere Markierung der Membran diente die fluoreszierende Chimäre des einwärts gleichrichtenden Kaliumkanals KAT1 (KAT1::GFP), einem für die stomatäre Funktion wichtigen Protein. Wenige Minuten nach Inkubation in FM-Farbstoffen wurden endozytische Strukturen im kortikalen Zytoplasma direkt unterhalb der PM angefärbt. Die Identifikation dieser Strukturen basiert auf dem Befund, dass ihre Größenverteilung mit der von endozytischen Vesikeln, die mit Patch-clamp Kapazitätsmessungen erhalten wurden, nahezu übereinstimmt. Alle endozytischen Markierungen, ob membran-affin (FM-Farbstoffe, KAT1::GFP) oder fluid-affin (Alexa 488 hydrazide), machten Strukturen mit beugungsbegrenztem Durchmesser und ähnlicher Lokalisation im kortikalen Zytoplasma sichtbar. Berechnungen zum mittleren Durchmesser der mit Alexa 488 Hydrazid markierten Strukturen ergaben Werte von 60 - 80 nm. Dies stimmt gut mit Durchmessern überein, die für Clathrin-umhüllte Vesikel in Pflanzen gefunden wurden. Darüber hinaus wurde ein Teil der Vesikel sowohl mit dem extrazellulär angebotenen Membranfarbstoff FM4-64 als auch mit dem intrazellulär produzierten KAT1::GFP markiert. Dies lässt den Schluss zu, dass diese Vesikel K+-Kanäle enthalten, die bereits zur PM transportiert und nun per Endozytose internalisiert wurden. Insgesamt zeigen die Befunde, dass turgeszente Schließzellen eine hohe konstitutive endocytische Aktivität aufweisen und neben Membran auch Proteine wie den K+-Kanal KAT1 endozytieren.


Abstract auf Englisch:

Stomata are found in the epidermis of photosynthetic active plant organs. They are formed by pairs of guard cells which create a pore to facilitate CO2 and water exchange with the environment. In order to control this gas exchange, guard cells actively change their volume and, consequently, surface area to alter the aperture of the stomatal pore. These changes are achieved by an uptake or release of K+ through K+-selective channels followed by the respective osmotic water fluxes. The quantification of such osmotically driven changes on 3D reconstructions revealed that guard cells of open and closed stomata of Vicia faba L., which show a 50 % change in aperture, differ in volume and surface area by 25 % and 15 %, respectively. Since biological membranes only have a limited elasticity of about 2 %, such excursions in surface area during stomatal movement require an addition or retrieval of membrane to or from the plasma membrane (PM). However, the relevance of endocytosis in plants has frequently been questioned on the basis of energetic considerations, because high turgor poses a barrier on the budding of the PM into vesicles. To investigate this process in highly turgescent guard cells, the dynamics of the PM were examined by monitoring with confocal microscopy the fate of membrane-affine styryl dyes (FM4-64, FM2-10, FM1-43) and the fluid-affine dye Alexa 488 hydrazide under natural and constant osmotic conditions. As a third marker, a relevant transporter for stomatal function was observed by following the retrieval of a fluorescent chimera of the K+-channel KAT1 (KAT1::GFP). Over some minutes of incubation in FM-dyes, endocytic vesicles in the cortical cytoplasm beneath the PMwere fluorescently labelled. The identification was based on the observation that the size distribution of these structures is very similar to that of endocytic vesicles obtained from patch-clamp capacitance recordings. All markers, whether membrane- (FM-dyes, KAT1::GFP) or fluid-phase-affine (Alexa 488 hydrazide), are taken up into structures of diffraction-limited size and similar localisation in the cortical cytoplasm. The calculated size of Alexa 488 hydrazide labelled structures was 60 - 80 nm. This is well in accordance with sizes reported for clathrin-coated vesicles in plants. Moreover, a subset of single vesicles was labelled with the externally supplied membrane marker FM4-64 and the intracellular produced KAT1::GFP. Consequently these vesicles carry K+-channels, which had already been delivered to the PM and are now retrieved via endocytosis. To summarize, the data provide strong evidence that turgid guard cells undergo vigorous constitutive endocytosis and retrieve membrane including the K+-channel KAT1 from the PM via endocytic vesicles.

Dokument aufgenommen :2004-12-13
URL:http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000507