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Untersuchungen zur Chromatinstruktur und DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in menschlichen Zellen mittels ionisierender Strahlung

Fricke, Andreas :
Untersuchungen zur Chromatinstruktur und DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in menschlichen Zellen mittels ionisierender Strahlung.
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2008)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchungen zur Chromatinstruktur und DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in menschlichen Zellen mittels ionisierender Strahlung
Language: German
Abstract:

In den letzten Jahren ist immer klarer geworden, dass in eukaryontischen Zellen die Genregulierung entscheidend von einer tertiären DNA-Struktur beeinflusst wird. Andere Hinweise deuten darauf hin, dass diese tertiäre Struktur ebenfalls einen Einfluss auf die Reparatur verschiedenster DNA-Schäden ausübt. Über die tertiäre Chromatinstruktur ist im Gegensatz zum primären und sekundären Level noch nicht sehr viel bekannt. Für ein volles Verständnis der Chromatinorganisation und deren funktionelle Bedeutung für die Genregulation ist es daher essentiell mehr über den Mechanismus und die Dynamik des Auf- und Abbaus dieser Struktur, sowie über deren 3D Arrangement zu erfahren. Neben der Limitierung der anwendbaren Methoden der Strukturaufklärung durch die Verwendung lebender Zellsysteme kommt erschwerend hinzu, dass die DNA auch einer intragenomischen Varianz oder einem Wandel durch den Zellzyklus unterliegen könnte. In der hier vorgestellten Arbeit wird als Lösung ein Konzept verwendet, dass auf der räumlichen Energiedeposition dicht ionisierender Strahlung beruht. So führt eine Bestrahlung mit hoch-LET Teilchen zu einer korrelierten Induktion von komplexen DNA-Doppelstrangbrüchen entlang der Teilchenbahn. Die resultierenden Fragmentverteilungen werden dabei nicht nur von den physikalischen Eigenschaften der Strahlungen beeinflusst, sondern auch durch die 3D-Organisation der DNA. So werden Stellen der DNA, die sich durch deren Struktur in enger räumlicher Nähe befinden, häufiger einen simultanen Schaden erhalten, als Stellen, welche sich räumlich weit voneinander entfernt befinden. Um den Einfluss der verschiedenen Strahlungen und der höher-geordneten Chromatinstruktur auf die Generierung doppelsträngiger DNA-Fragmente zu untersuchen, wurde ein Assay basierend auf einer Pulsfeldgelelektrophorese und anschließender Southern-Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNA-Sonden entwickelt. Die erhaltenen Fragment-Verteilungen als Funktion der Wanderungsstrecke wurden für mehrere Fluenzen unterschiedlichster Strahlungen analysiert. Die Verteilungen zeigten, dass sich nach einer Bestrahlung mit hoch-LET Teilchen zwei deutlich sichtbare Maxima herausbilden. Die Anwesenheit zweier Maxima unterstützt wiederum die Annahme, dass die gemessen Verteilung eine Summe aus zwei verschiedenen Fragmentklassen widerspiegelt. Die erste Klasse, die inter-Track Fragmente, werden durch zwei Teilchenbahnen generiert. Eine Erhöhung der Fluenz führt zu einer Verschiebung des Maximums dieser Fragmente zu kleinerem Molekulargewicht. Diese Fragmentklasse enthält keinerlei biologisch strukturelle Informationen. Die zweite Klasse, die intra-Track Fragmente, werden nur durch ein einziges Teilchen erzeugt. Das Maximum dieser intra-Track Fragmente verschiebt sich mit Zunahme der Fluenz nicht. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass dieses Maximum nahezu unabhängig von der eingesetzten Strahlenart ist und gegen ein Molekulargewicht von circa 500 kbp konvergiert. Da dieses Maximum der intra-Track Fragment unabhängig von physikalischen Parametern ist, kann es eine Größenordnung der höher-geordneten Chromatinstruktur aufzeigen.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
It is becoming increasingly clear that higher-order chromatin structure plays a critical role in many aspects of gene regulation in eucaryotic cells. There is good evidence that the repair of various DNA lesions is also influenced by the structure and density of chromatin. Whereas the structure of DNA is well understood on the primary and secondary level of chromatin organization, not much is known about the tertiary structure. Full understanding of chromatin organization and its functional significance will require knowledge of the 3D arrangements of components, and the mechanisms and dynamics of their assembly and disassembly. Variations in the intra-genomic organization or during the cell cycle, and the number of applicable techniques that can be used in living cells, make it difficult to analyze this higher-order chromatin structure. In the present study a concept based on the spatial distribution of energy deposition of densely ionizing radiation is utilized. High LET radiation causes complex types of DNA double-stranded breaks which are formed in a correlated manner along the particle track. These distributions of DNA fragments are influenced by the physical properties of the different radiation qualities used, and also by the 3D organization of the DNA in the nucleus. Sites which are brought into close spatial proximity by the chromatin organization are more likely to become simultaneously damaged by a single particle track than sites which are kept distant. To investigate DNA fragment size distributions depending on radiation quality and higher-order chromatin structure, an assay based on pulsed-field gel electrophoresis and Southern hybridization with radiolabelled DNA probes was performed. Mass distributions of DNA fragments as a function of migration distance for equal particle fluences of different radiation qualities were analyzed. In distributions obtained after high LET exposure, two-peak-like overrepresentations of fragments were detectable. The behaviour of these maxima supports our idea that the distributions represent a summation of two types of fragments. The first type, the inter-track fragments, are generated by two particle tracks. With increasing fluence, distributions of such fragments shift to lower molecular weight. However, they carry no structural information and obscure the analysis. The second type of fragments is generated by single particle tracks. The molecular weight of these intra-track fragments is independent of particle fluence. Additionally, it is shown that the maxima of the intra-track distributions are nearly independent of radiation quality and, with increasing LET, converge towards 500 kbp. I propose that this fragment size represents an element of higher-order chromatin structure.English
Uncontrolled Keywords: DNA, DSB, H2AX, repair, fragment
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
DNA, DSB, H2AX, repair, fragmentEnglish
Classification DDC: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:53
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-9834
License: Creative Commons: Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 3.0
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus and Kraft, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 29 April 2008
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/983
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