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Improved Drug Delivery of next-generation Antibody-Drug Conjugates by utilizing tumor-associated proteases

Roßkopf, Janis Mario (2019):
Improved Drug Delivery of next-generation Antibody-Drug Conjugates by utilizing tumor-associated proteases.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00009685,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Improved Drug Delivery of next-generation Antibody-Drug Conjugates by utilizing tumor-associated proteases
Language: English
Abstract:

Targeted therapy with tumor-specific antibodies established in clinical oncology over the past decades with a variety of approved drugs. However, antibodies targeting cell surface antigens also suffer from limitations. Therapeutic agents must reach all tumor cells in cancer therapy, as untreated regions can lead to tumor recurrence. Poor penetration and drug delivery of conventional antibody-based drugs remain a major challenge for effective treatment of solid tumors. In the context of antibody-drug conjugates (ADCs), many research efforts focused on new linker chemistry, optimization of cytotoxic drugs and site-specific conjugation technologies. Less attention was drawn to the underexplored targeting scaffold of the antibody portion or antibody alternatives for optimizing drug delivery. Especially, the molecular size of the ADC pharmacodelivery vehicle plays a key role to deliver the cytotoxic payload to tumor cells.

In the presented study, the effect of molecular weight and valency on tumor penetration and efficacy was investigated, introducing a novel ADC design. In this novel design an additional protease cleavage site was engineered into the IgG1 hinge region. This protease site is sensitive to enzymes commonly active in the tumor microenvironment, resulting in the release of 2 Fab-drug conjugates from the original ADC. The hinge cleavable ADC was evaluated for the tumor penetration ability and efficacy of Fab-drug conjugates (FDCs) that are generated locally by extracellular tumor proteases while retaining the half-life of the full-length antibody in systemic circulation. Homogeneous ADCs and FDCs with cytotoxic payloads MMAE and MMAF were generated by site-specific conjugation to the light chains of antibodies or antibody fragments using sortase A. Proteolytic cleavage reactions and enzyme kinetics displayed a fast and efficient release of FDCs from the full-length ADC by tumor-associated proteases urokinase-type plasminogen activator (uPA) and matriptase (MT-SP1). The designed anti-HER2 Trastuzumab ADCs and FDCs retained antigen binding properties, were stable in mouse serum and demonstrated high in vitro potency and cancer cell killing ability in HER2-overexpressing cell lines. For assessment of a better tumor localization, preparation as antibody-fluorophore conjugates for imaging analysis was achieved with Alexa Fluor 488. Enzymatically generated Fab-fluorophore fragments were able to penetrate and distribute more evenly within tumor spheroids compared to full-length IgG antibodies. A correlation was observed between reduced molecular size of the pharmacodelivery vehicle and tumor penetration and distribution ability. In vitro imaging analysis of tumor spheroids demonstrated increased molecular size and increased cellular binding resulted in decreased tumor penetration.

Hence, the presented work showed promising results for the in situ generation of FDCs from IgG-ADCs that might have a potential benefit against solid tumors in terms of tumor penetration and localization. Moreover, an improved tumor to blood ratio with FDCs can be expected that could also result in reduced adverse effects. Further in vivo evaluation is necessary to optimize the balance between optimum tumor penetration and accumulation, molecular size of the targeting scaffold and pharmacokinetic properties.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die zielgerichtete Therapie mit tumor-spezifischen Antikörpern hat sich im Laufe der Zeit in der klinischen Onkologie etabliert, was durch die Vielzahl an zugelassenen Medikamenten belegt ist. Dennoch gibt es Limitationen bei Antikörpern, die Zelloberflächenantigene adressieren. Onkologische Therapeutika müssen im Rahmen der Tumortherapie in der Lage sein, alle Krebszellen zu erreichen. Wenn unbehandelte Regionen nicht therapiert werden, können diese zu einem Tumor-Rezidiv führen. Die verringerte Tumorpenetration und Wirkstoffabgabe von herkömmlichen Antikörper-basierten Medikamenten stellen eine große Herausforderung für die effektive Behandlung von soliden Tumoren dar. Im Rahmen von Antikörper-Wirkstoff Konjugaten (ADCs), fokussierten sich die größten Forschungsaktivitäten auf neuartige Linker Strukturen, Optimierungen von zytotoxischen Arzneistoffen und Technologien für Positions-spezifische Konjugationen. Weniger Beachtung erhielt die Modifikation des Antikörpergrundgerüsts oder Antikörperalternativen für die Optimierung des Arzneistofftransports. In diesem Kontext spielt die Molekülgröße des ADC Transportvehikels eine essenzielle Rolle für den Transport des zytotoxischen Wirkstoffs zu den Tumorzellen. In der vorliegenden Studie wurde die Auswirkung des Molekulargewichts und der Valenz auf die Tumorpenetration und die Wirksamkeit untersucht. In diesem Zuge wurde ein neuartiges ADC Design ausgearbeitet und dessen Funktionalität experimentell bestätigt. In einen ADC im IgG Format wurde eine Protease-Schnittstelle in die IgG1 Hingeregion eingefügt, welche von überexprimierten Enzymen des umliegenden Tumorgewebes gespalten werden kann. Die Spaltung resultiert in 2 Fab Fragmente und einen Fc Anteil. Der Hinge spaltbare ADC wurde hinsichtlich der Tumorpenetration und der Wirksamkeit von Fab-Wirkstoff Konjugaten (FDCs) evaluiert, die mittels enzymatischer Spaltung durch Tumorproteasen lokal freigesetzt werden können. Im Gegensatz zu der kurzen Halbwertszeit der im Tumorgewebe lokal freigesetzten Fabs, behält der ADC im ungespaltenen Zustand in systemischer Zirkulation die für ADCs typischerweise längere Halbwertszeit. ADCs und FDCs mit den zytotoxischen Wirkstoffen MMAE und MMAF wurden durch Positions-spezifische Konjugation mittels Sortase A an die leichte Kette der Antikörper und Antikörper Fragmente hergestellt. Proteolytische Spaltungsreaktionen und Enzymkinetiken offenbarten eine schnelle sowie effiziente Freisetzung der jeweiligen FDCs vom Volllängen ADC durch die Tumorproteasen urokinase-type plasminogen activator (uPA) und matriptase (MT-SP1). Die hergestellten anti-HER2 ADCs und FDCs behielten ihre Antigen Bindeeigenschaften, waren im Mausserum stabil und zeigten vergleichbare in vitro Potenz und Aktivität gegenüber einem nicht spaltbaren Kontrollkonstrukt auf HER2-überexprimierenden Tumorzellen. Um eine bessere Tumorlokalisation beurteilen zu können, wurden Antikörper-Fluorophor Konjugate mit Alexa Fluor 488 hergestellt. Im Vergleich zu Volllängen IgG Antikörper zeigen enzymatisch hergestellte Fab-Fluorophor Konjugate eine gleichmäßige Penetration und Verteilung in Tumor Spheroid Modellen. Hierbei korrelierte eine tiefere Penetration und homogenere Verteilung im Spheroid mit der geringeren Molekülgröße des Transportvehikels. Diese Arbeit zeigt vielversprechende Ergebnisse der in situ generierten FDCs aus den Hinge spaltbaren IgG-ADCs, die einen potenziellen Benefit gegen solide Tumore im Hinblick auf Tumorpenetration und -lokalisation bringen könnten. Darüber hinaus ist ein verbessertes Tumor zu Blut Verhältnis von FDCs zu erwarten, dass in einem verringertem Auftreten von Nebenwirkungen resultieren könnte. Ob sich die in vitro gezeigte verbesserte Tumorpenetration auch in vivo translatieren lässt, kann abschließend nur durch ein Tiermodell belegt werden. Die Einblicke einer in vivo Studie kann Aufschlüsse darüber geben, die Balance zwischen der optimalen Tumorpenetration und –akkumulation, dem Molekulargewicht des Transportvehikels und der Pharmakokinetik zu optimieren.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 17 Dec 2019 15:38
Last Modified: 09 Jul 2020 02:59
DOI: 10.25534/tuprints-00009685
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-96852
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Neumann, Prof. Dr. Siegfried
Refereed: 2 December 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/9685
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