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A Calcium imaging setup at the single ion hit facility at GSI and its application to the investigation of Calcium response to ion irradiation in mammalian cells

Du, Guanghua :
A Calcium imaging setup at the single ion hit facility at GSI and its application to the investigation of Calcium response to ion irradiation in mammalian cells.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2008)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: A Calcium imaging setup at the single ion hit facility at GSI and its application to the investigation of Calcium response to ion irradiation in mammalian cells
Language: English
Abstract:

This thesis reports the construction of a Calcium imaging system at the single ion hit facility at GSI and its application to the investigation of Calcium responses to ion irradiation in mammalian cells. It has been recently reported that not only Calcium ions regulate the cellular responses to ionizing radiation but also that cells show intracellular Calcium responses to ionizing radiation. All previous investigations on this matter were so far done with ionizing radiations with a low linear-energy-transfer (LET). Here we are interested in the Calcium response of cells exposed to heavy ion irradiation, which has a much higher LET and has not been investigated before. To accomplish this, a Calcium imaging system based on ratiometric fluorescence imaging was built at the single ion hit facility for cell irradiation at GSI. The signal-to-noise ratio of the measurements based on fluorescence images reached an average of 96:1 using established image analysis methods. The setup successfully detected the expected Calcium responses in cells treated with Hydrogen Peroxide and spontaneous Ca2+ oscillations in AG1522 cells. These oscillations occurred in standard cell dishes which were sealed air-tight, and could be prevented by using gas permeable cell dishes for experiments. In parallel, the targeting stability of the single ion hit facility was improved and a technique, namely an online hit verification method, was developed to check the targeting accuracy before the cell irradiation. Using the combination of the Calcium imaging system and the single ion hit facility, the intracellular Calcium concentration was examined in HeLa cells and human foreskin fibroblast AG1522-D cells before and immediately after irradiation with 4.8 MeV/nucleon Carbon or Argon ions. No changes of intracellular Calcium level was observed in these two cell lines, both in cell dishes with hypoxic stress or in gas permeable cell dishes without stress. The irradiated AG1522-D samples showed the same behavior of Calcium signaling as control samples under hypoxia stress, under the aspects of the percentage of responding cells, the onset of the oscillations, the frequency and amplitude of the oscillations. It is concluded from these experiments that ion irradiation, and the subsequent cellular responses such as DNA double strand break and phosphorylation of H2A histone protein, do neither induce Calcium signaling nor influence Calcium signaling cascades stimulated by hypoxia stress.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Thema dieser Arbeit sind Aufbau eines Calcium-Imaging Systems an der Schwerionen-Mikrosonde der GSI und die Untersuchung der Calciumantwort von Säugertierzellen auf Ionenbestrahlung. Es wurde berichtet, dass Calciumionen die zelluläre Antwort auf ionisierende Strahlung regulieren können und dass die ionisierende Strahlung selbst intrazelluläre Calcium-Signalkaskaden auslösen kann. Alle bisherigen Experimente wurden mit ionisierenden Strahlungen von niedrigem Linear-Energy-Transfer (LET) durchgeführt. Ähnliche Experimente werden bisher noch nicht mit hoch-LET Schwerionenbestrahlung durchgeführt. Diese Arbeit behandelt daher die Calciumantwort von Zellen auf Schwerionenbestrahlung. Für diese Untersuchungen wurde ein Calcium-Imaging System, basierend auf einer ratiometrischen Fluoreszenzbildgebung, an der Einzelionen-Bestrahlungsapparatur der GSI konstruiert. Das Signal-zu-Rausch Verhältnis der Messungen, die auf der Analyse von Fluoreszenzbildern basierten, erreichte im Mittel 96:1. Der Messaufbau war in der Lage die erwartete Calciumantwort von Zellen, die mit Wasserstoffperoxid stimuliert wurden zu registrieren. Ferner war der Messaufbau geeignet um "spontane Ca2+ Oszillationen" in den Zellen nachzuweisen. Kontrollexperimente deckten auf, dass diese spontanen Ca2+ Oszillationen in AG1522 Zellen das Resultat eines Hypoxie-Stresses sind, der in den gasdichten Standard Zellgefäßen auftritt. Die Oszillationen konnten umgangen werden, indem man gasdurchlässige Zellgefäße benutzte. Gleichzeitig zu dem Calcium-Imaging System, wurde die Zielstabilität der Einzelionen-Bestrahlungsapparatur verbessert und eine Technik, nämlich eine Online-Treffe-Verifikation Methode entwickelt, um die Zielgenauigkeit vor der Zellbestrahlung sicherzustellen. Mit Hilfe der Kombination aus Calcium-Imaging System und Einzelionen-Bestrahlungsapparatur wurde die intrazelluläre Calciumkonzentration in HeLa Zellen und in menschlichen Vorhautfibroblasten AG1522-D vor und direkt nach der Bestrahlung mit 4.8 MeV/Nukleon Kohlstoff- oder Argonionen untersucht. In keinem Fall wurde eine strahleninduzierte Änderung der intrazellulären Calciumkonzentration in diesen zwei Zelllinien beobachtet. Das gilt sowohl für Experimente in den gasundurchlässigen wie auch in den gasdurchlässigen Zellgefäßen. Unter hypoxischen Bedingungen zeigen die bestrahlten AG1522-D Zellen das gleiche Calciumverhalten wie die Kontrollen hinsichtlich der Anzahl an oszillierenden Zellen, Einsetzen der Oszillationen, Frequenz und der Amplitude der Oszillationen. Aus diesen Experimenten folgt, dass Ionenbestrahlung und die folgenden zelluläre Antwort wie DNA Doppelstrangbruch und Phosphorylierung des H2A Histonproteins, weder ein Calcium-Signal induzieren, noch eine durch Hypoxie-Stress bedingte Calcium-Signalkaskade beeinflussen.German
Uncontrolled Keywords: Calciumkonzentration, Ionisierende Strahlung, HeLa-Zelle, Fibroblast, Mikrosonde
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Calciumkonzentration, Ionisierende Strahlung, HeLa-Zelle, Fibroblast, MikrosondeGerman
single-ion-hit facility, calcium imaging, LETEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:53
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000957
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-9574
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Löbrich, Prof. Dr. Markus
Advisors: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Kraft, Prof. Dr. Gerhard and Löbrich, Prof. Dr. Markus
Refereed: 29 January 2008
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/957
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