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Analyses of IgE-epitope profiles from legume allergens as approach towards the development of novel diagnostic and therapeutic reagents in food allergy

Popp, Jasmin (2019):
Analyses of IgE-epitope profiles from legume allergens as approach towards the development of novel diagnostic and therapeutic reagents in food allergy.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00009479,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Analyses of IgE-epitope profiles from legume allergens as approach towards the development of novel diagnostic and therapeutic reagents in food allergy
Language: English

Legumes are an important source of high-value proteins and edible oils in the human diet. However, they are also a known and frequent source of severe allergic reactions to foods. Immediate-type allergic reactions are elicited by allergenic proteins (allergens), mediated by their interaction with the immune system via allergen-specific antibodies of the isotype immunoglobulin E (IgE). These specific IgE antibodies to total protein of the allergenic food, e.g. peanut, can be measured in vitro to diagnose an allergic sensitization. While specific IgE to total protein extracts indicates a sensitization, it is not necessarily a proof for clinical reactivity. In contrast, the measurement of specific IgE to selected allergen components, such as the peanut 2S albumin Ara h 2, has been proposed to improve the in vitro diagnostic specificity for a clinical reactivity. In this context, specific recognition patterns of IgE binding at the protein level, and further at the peptide level, may allow the development of advanced diagnostic approaches, and innovative therapeutic reagents. However, knowledge about the relevance of allergenic storage proteins, such as 2S albumins and 7S globulins, of the legumes peanut, pea and soybean and their IgE-binding peptides is in part controversial or limited. Therefore, this study aimed to determine the serum IgE binding of legume-allergic versus sensitized but clinically tolerant children to homologous 2S and 7S legume allergens from peanut, pea and soybean at the protein and peptide level. In this study, sera from legume-allergic as well as sensitized but clinically tolerant children with legume extract-specific IgE ≥ 0.35 kUA/L were included. Total protein extracts and recombinant 7S globulins and 2S albumins of peanut, pea, and soybean, respectively, were prepared. Afterwards, serum IgE binding to legume extracts and recombinant legume allergens was individually determined by means of densitometric immunoblot analysis. Overlapping peptides (15 AA; offset 4 AA) representing the full-length allergens were synthesized and analyzed for their ability to bind serum IgE on CelluSpotTM multipeptide microarrays. The influence of post-translational hydroxylation of proline residues in peanut Ara h 2 on the capacity to bind serum IgE and thus on the diagnostic value was additionally investigated on the peptide level. Potential candidate diagnostic peptides specific for peanut and pea allergy were identified, according to predefined selection criteria that were established in this study. Finally, the diagnostic value of the investigated recombinant legume allergens and of the potential candidate diagnostic peptides was determined as area under curve (AUC) by receiver operating characteristic (ROC) curve analysis. By doing so, it should be determined whether peptides may serve as additional or alternative reagents in the in vitro diagnosis of legume allergy. However, due to the very limited number of available and included soybean-allergic patients, soybean was excluded from a detailed analysis of candidate diagnostic peptides and ROC curve analysis. According to immunoblot analysis and the specific limit of detection, serum IgE of 48%, 79% and 50% of peanut-, pea- and soybean-allergic children bound to the 7S globulins rAra h 1, rPis s 1 and rGly m 5.03, respectively. Of the peanut-, pea- and soybean-sensitized but tolerant children 8%, 20% and 20% showed a serum IgE binding to the respective 7S globulins. The most striking difference between the three legumes could be observed regarding the relevance of the 2S albumins. In immunoblot analysis, 65% and 78% of peanut-allergic children showed a serum IgE binding to rAra h 2.01 and rAra h 2.02, respectively. In contrast, serum IgE of peanut-sensitized but tolerant patients did not bind to any of both Ara h 2 isoforms. Hence, the relevance and the diagnostic value of both 2S albumin isoforms, especially of rAra h 2.02, in peanut allergy were further highlighted. Based on immunoblot analyses, such clinical relevance of 2S albumins could not be found in pea and soybean. Here, negligible or no serum IgE binding to 2S albumins was detectable in pea- as well as soybean-allergic children. Based on the ROC curve analysis of the investigated recombinant proteins analyzed in immunoblot, rAra h 2.02 (AUC 0.86) and rPis s 1 (AUC 0.86) had the highest diagnostic value in peanut and pea allergy, respectively, also compared to the respective total legume protein extract. With regard to potential diagnostic peptides, two Ara h 2-derived peptide pairs (AUC 0.87-0.90) with a diagnostic value comparable to that of full-length rAra h 2.02 (AUC 0.86) could be identified for peanut allergy. Each of the two peptide pairs contains at least one peptide with hydroxylated proline residues. In addition, it could be observed that hydroxylation of proline residues in Ara h 2-derived peptides increased the sensitivity while maintaining the specificity which makes this post-translational modification an interesting target for future diagnostic approaches. Moreover, for pea allergy eleven candidate diagnostic peptides of Pis s 1 could be identified. Compared to pea extract and rPis s 1, the candidate peptides had, with an AUC of 0.99, the highest diagnostic value in this pea study population. In this pediatric study population, general differences in allergenic potency of the 2S and 7S storage proteins of the three investigated legumes were apparent. In peanut, Ara h 1 and Ara h 2 could be identified as relevant allergens. However, based on immunoblot analysis, the 2S albumin Ara h 2, in particular the isoform Ara h 2.02, was the most relevant allergen with the highest diagnostic value in this peanut study population. In contrast, in pea and soybean 2S albumins were excluded as relevant allergens in this study. In pea, the 7S globulin Pis s 1 was identified as a major and immunodominant allergen. A similar trend seemed to be observed for Gly m 5.03 and soybean, but due to the limited number of soybean-allergic patients included in this study, no further conclusions can be drawn. In addition, the investigation of IgE binding at the linear peptide level revealed that peptides with a diagnostic value that is comparable or even better than that of the respective full-length recombinant proteins could be identified. These peptides may potentially serve as additional or alternative reagents in the in vitro diagnosis of legume allergy; however, this requires verification in a prospective study. Moreover, based on this study, additional knowledge about relevant allergens and their IgE-binding sites was obtained. This knowledge can support the development of novel therapeutic reagents with improved characteristics. In this context, IgE binding to short peptides of allergens was investigated to localize IgE-binding sites in approximation to linear (continuous) IgE epitopes. It could be shown that linear IgE-binding epitopes of natural Ara h 2, as represented by a 27-mer peptide, still induced relevant mast cell degranulation. This finding underpins the potential relevance of linear IgE-binding sites with regard to total allergenic potency, and should thus be considered in the development of novel reagents for the immunotherapeutic treatment of peanut allergy as otherwise patients might be at high risk of unintended side effects. In addition, identified immunodominant IgE-binding sites of Pis s 1 may allow the development of hypoallergenic substitution variants for allergen-specific immunotherapy of pea allergy. The relevance of these findings with regard to efficacy and safety can be further addressed in preclinical models of peanut and pea allergy, respectively.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Hülsenfrüchte (Leguminosen) sind eine wichtige Nahrungsquelle für hochwertige Proteine und pflanzliche Öle. Jedoch sind sie auch als Auslöser schwerer allergischer Reaktionen bekannt. Allergische Reaktionen vom Soforttyp werden durch allergene Proteine (Allergene) ausgelöst, vermittelt durch deren Interaktion mit dem Immunsystem über allergenspezifische Antikörper vom Typ Immunglobulin E (IgE). Um eine allergische Sensibilisierung zu diagnostizieren, können diese spezifischen IgE-Antikörper gegen Gesamtproteinextrakt des allergenen Lebensmittels, wie z.B. Erdnuss, in vitro bestimmt werden. Eine Sensibilisierung gegen Gesamtproteinextrakt ist jedoch nicht zwangsläufig ein Beleg für eine klinisch relevante Allergie. Um die diagnostische Spezifität zu erhöhen, wurde in den letzten Jahren vermehrt das spezifische IgE gegen einzelne Allergenkomponenten bestimmt. In diesem Zusammenhang wird z.B. das 2S Albumin aus Erdnuss, Ara h 2, als diagnostischer Marker für eine klinisch relevante Erdnussallergie beschrieben. Demnach könnten spezifische IgE-Bindungsmuster auf Protein- und Peptidebene als Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer diagnostischer, aber auch therapeutischer Werkzeuge dienen. Jedoch ist die Relevanz allergener Speicherproteine, wie den 2S Albuminen und den 7S Globulinen, aus Erdnuss, Erbse und Soja teils unbekannt oder wird kontrovers diskutiert. Gleiches gilt für deren IgE-Bindungsstellen. Daher war das Ziel dieser Arbeit, die IgE-Bindung von Leguminosenallergikern und Patienten, welche eine Leguminosensensibilisierung aufweisen, aber klinisch tolerant sind, zu vergleichen. Hierfür wurde die IgE-Bindung der allergischen und toleranten Patienten an homologe 2S- und 7S-Leguminosenallergene aus Erdnuss, Erbse und Soja auf Protein- und Peptidebene bestimmt. In diese Arbeit wurden Seren von allergischen und sensibilisierten, aber toleranten, Kindern mit einem Leguminosenextrakt spezifischem IgE ≥ 0.35 kUA/L eingeschlossen. Für die Untersuchungen wurden jeweils Gesamtproteinextrakte und rekombinante 7S Globuline und 2S Albumine aus Erdnuss, Erbse und Soja hergestellt. Anschließend wurde in Immunoblot-Analysen die IgE-Bindung an die Extrakte und die rekombinanten Leguminosenallergene bestimmt und das spezifische IgE densitometrisch quantifiziert. Zur Untersuchung der IgE-Bindung auf Peptidebene wurden überlappende Peptide (15 Aminosäuren lang, 4 Aminosäuren Überlappung) aller untersuchten Leguminosenallergene synthetisiert und mittels CelluSpotTM-Multipeptidmikroarrays gegen die Patientenseren getestet. Zusätzlich wurde auf Peptidebene der Einfluss der posttranslationalen Prolinhydroxylierung von Ara h 2 aus Erdnuss auf dessen IgE-Bindungsfähigkeit und auf die diagnostische Genauigkeit untersucht. Für Erdnuss- und Erbsenallergie konnten, gemäß der in dieser Studie festgelegten Selektionskriterien, spezifische diagnostische Kandidatenpeptide identifiziert werden. Anschließend wurde mittels ROC-Kurvenanalyse (Receiver Operating Characteristic) der diagnostische Vorhersagewert der einzelnen rekombinanten Allergene und der spezifischen Kandidatenpeptide bestimmt und miteinander verglichen. Dadurch sollte bestimmt werden, ob Peptide als zusätzliche oder alternative Reagenzien in der in-vitro-Allergiediagnostik eingesetzt werden können. Aufgrund der sehr begrenzten Anzahl an verfügbaren und eingeschlossenen Sojaallergikern wurde Soja jedoch von einer detaillierten Peptid- und ROC-Kurvenanalyse ausgeschlossen. Basierend auf den Immunoblot-Analysen und den jeweiligen Nachweisgrenzen zeigten 48%, 79% und 50% der Erdnuss-, Erbsen- und Sojaallergiker jeweils eine Serum IgE-Bindung an die 7S Globuline rAra h 1, rPis s 1 und rGly m 5.03. Im Gegensatz dazu zeigten von den gegen Erdnuss, Erbse und Soja sensibilisierten, aber klinisch toleranten Kindern jeweils nur 8%, 20% und 20% eine IgE-Bindung an die entsprechenden 7S Globuline. Der auffälligste Unterschied zwischen den drei Leguminosen zeigte sich jedoch in Bezug auf die Relevanz der 2S Albumine. In der Immunoblot-Analyse zeigten jeweils 65% und 78% der erdnussallergischen Kinder eine IgE-Bindung an rAra h 2.01 bzw. rAra h 2.02. Im Gegensatz dazu zeigten die gegen Erdnuss sensibilisierten, aber klinisch toleranten Kinder keinerlei Bindung an die beiden Ara h 2 Isoformen. Diese Entdeckung unterstreicht die Relevanz und den diagnostische Wert der beiden Isoformen, insbesondere von Ara h 2.02, in der Vorhersage einer klinisch relevanten Erdnussallergie. Solch eine klinische Relevanz der 2S Albumine konnte in Erbse und Soja, basierend auf den Immunoblot-Analysen, nicht nachgewiesen werden. Hier zeigte sich eine vernachlässigbare oder fehlende IgE-Bindung der erbsen- und sojaallergischen Kinder an die jeweils untersuchten 2S Albumine. Eine ROC-Kurvenanalyse der mittels Immunoblot untersuchten rekombinanten Proteine ergab, dass rAra h 2.02 (AUC (Area under curve) 0.86) und rPis s 1 (AUC 0.86) den höchsten diagnostischen Vorhersagewert für eine klinisch relevante Erdnuss- bzw. Erbsenallergie besaßen, auch im Vergleich zum jeweiligen Leguminosenextrakt. Im Hinblick auf potenzielle diagnostische Peptide konnten bei Ara h 2 zwei Peptidpaare (AUC 0.87-0.90) mit einem diagnostischen Vorhersagewert identifiziert werden, welcher mit dem des Volllängenproteins rAra h 2.02 (AUC 0.86) vergleichbar war. Jedes der beiden Peptidpaare enthielt mindestens ein Peptid mit hydroxylierten Prolinresten. Darüber hinaus konnte für Peptide von Ara h 2 beobachtet werden, dass die Hydroxylierung von Prolinresten die Sensitivität bei gleichbleibender Spezifität erhöht, was diese posttranslationale Modifikation zu einem interessanten Ziel für zukünftige diagnostische Ansätze macht. Für eine mögliche in-vitro-Diagnostik der Erbsenallergie konnten elf diagnostische Peptide von Pis s 1 identifiziert werden, welche mit einer AUC von 0.99, verglichen mit Erbsenextrakt (AUC 0.81) und rPis s 1 (AUC 0.86), den höchsten diagnostischen Vorhersagewert in dieser Studienpopulation hatten. Zusammengefasst waren in dieser pädiatrischen Studienpopulation signifikante Unterschiede hinsichtlich der allergenen Potenz der 2S und 7S Speicherproteine in den drei untersuchten Hülsenfrüchten erkennbar. In Erdnuss konnten Ara h 1 und Ara h 2 als relevante Allergene identifiziert werden. Jedoch zeigte sich, basierend auf den Immunoblot-Analysen, dass das 2S Albumin Ara h 2 und insbesondere die Isoform Ara h 2.02 das relevanteste Allergen mit dem höchsten diagnostischen Vorhersagewert in dieser Studienpopulation war. Im Gegensatz dazu konnten in dieser Studie die 2S Albumine aus Erbse und Soja als relevante Allergene ausgeschlossen werden. Wohingegen das 7S Globulin Pis s 1 als Haupt- und immunodominantes Allergen in Erbse identifiziert werden konnte. Ein ähnlicher Trend schien sich bei Gly m 5.03 aus Soja abzuzeichnen. Aber aufgrund der sehr begrenzten Anzahl an eingeschlossenen sojaallergischen Kindern, ließen sich keine weiteren Schlussfolgerungen ziehen. Darüber hinaus ergab die Untersuchung der IgE-Bindung auf Peptidebene, dass Peptide mit einem diagnostischen Vorhersagewert identifiziert werden konnten, welcher vergleichbar oder sogar besser als der der jeweiligen rekombinanten Volllängenproteine war. Diese Peptide können möglicherweise als zusätzliche oder alternative Reagenzien in der in-vitro-Allergiediagnostik dienen. Dies erfordert jedoch zunächst eine weitere Überprüfung in einer prospektiven Studie. Außerdem wurden auf der Grundlage dieser Arbeit neue Erkenntnisse über relevante Allergene und deren IgE-Bindungsstellen gewonnen, welche die Entwicklung neuartiger therapeutischer Reagenzien mit verbesserten Eigenschaften unterstützen können. In diesem Zusammenhang wurde die IgE-Bindung an lineare Peptide in Annäherung an lineare IgE-Epitope untersucht. Anhand eines 27-mer Peptids, welches hydroxylierte Prolinreste enthielt, konnte eindeutig gezeigt werden, dass lineare IgE-bindende Epitope von natürlichem Ara h 2 eine relevante Mastzelldegranulation induzieren können. Dieses Resultat unterstreicht die potenzielle Relevanz linearer IgE-Bindungsstellen bezüglich der Gesamtallergenität und sollte daher bei der Entwicklung neuer immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung von Erdnussallergien berücksichtigt werden, da andernfalls Patienten einem höheren Risiko unerwünschter Nebenwirkungen ausgesetzt sein könnten. Darüber hinaus können die in dieser Studie identifizierten immunodominanten IgE-Bindungsstellen von Pis s 1 als Grundlage für die Entwicklung von hypoallergenen Substitutionsvarianten für die allergenspezifische Immuntherapie von Erbsenallergien dienen. Die Relevanz dieser Ergebnisse sollte in Bezug auf Wirksamkeit und Sicherheit in präklinischen Studien zur Therapie von Erdnuss- bzw. Erbsenallergie weiter untersucht werden.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 13 Dec 2019 13:28
Last Modified: 09 Jul 2020 02:54
DOI: 10.25534/tuprints-00009479
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-94798
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Holzhauser, PD Dr. Thomas
Refereed: 22 November 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/9479
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