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Transkriptionelle Regulation des microRNA Clusters 144-451 während der Hämatopoese sowie Leukämogenese

Sahner, Nicole (2019):
Transkriptionelle Regulation des microRNA Clusters 144-451 während der Hämatopoese sowie Leukämogenese.
Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00009465,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Transkriptionelle Regulation des microRNA Clusters 144-451 während der Hämatopoese sowie Leukämogenese
Language: German
Abstract:

Hämatopoese bezeichnet den Prozess der Blutzellbildung ausgehend von hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Aus HSCs entstehen multipotente Vorläuferzellen, die je nach Entwicklungslinie sich in oligopotente myeloide bzw. lymphoide Vorläuferzellen differenzieren können. Über weitere Entwicklungs- und Differenzierungsschritte entstehen schließlich ausdifferenzierte, reife Blutzellen, wie z.B. Erythrozyten oder B-Zellen. Die Regulation der hämatopoetischen Differenzierung unterliegt hierbei einer Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen sowie Faktoren. Neben Zytokinen beeinflussen Transkriptionsfaktoren in einem präzise abgestimmten und hoch komplexen Netzwerk die Regulation der einzelnen Differenzierungsprozesse. Tal und RUNX1 gehören zu den essentiellen hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren und sind u.a. für die Differenzierung der HSCs zu Erythrozyten sowie Megakaryozyten von großer Bedeutung. Des Weiteren sind microRNAs an vielen regulatorischen Prozessen der Hämatopoese beteiligt. Sie steuern sowohl die Selbsterneuerung der HSCs als auch deren Differenzierung in reife Blutzellen. MicroRNAs können hierbei sowohl von Transkriptionsfaktoren reguliert werden als auch deren Wirkung beeinflussen. So wird die Expression der microRNA miR 451, welche zusammen mit miR-144 in einem Cluster lokalisiert ist, spezifisch durch den erythroiden Transkriptionsfaktor GATA-1 während der erythroiden Differenzierung induziert. Die Anwesenheit der miR-451 wiederum ist essentiell für die terminale Erythropoese. Darüber hinaus konnte in Studien gezeigt werden, dass die Expression der miR-451 in verschiedenen malignen Erkrankungen dereguliert ist und diese daher als diagnostischer Biomarker relevant sein könnte. Während der Leukämogenese sind diese essentiellen Bestandteile des regulatorischen Netzwerks vielfach Ziel von genetischen Modifikationen. Diese können u.a. zu einer aberranten Expression des Faktors oder gar zur Bildung von leukämischen Fusionsproteinen führen. So entsteht durch die chromosomale Translokation t(8;21)(q22;q22) das leukämischen Fusionsproteins RUNX1-ETO. Dieses wird in 12% aller akuten myeloischen Leukämieerkrankungen nachgewiesen und besteht aus der N-terminalen Sequenz von RUNX1 und nahezu der vollständigen ETO-Sequenz am C-Terminus. Auf diese Weise kombiniert RUNX1-ETO das DNA-Bindemotiv von RUNX1 (RHD-Domäne) mit den NHR-Domänen, die u.a. die Interaktion mit Co-Repressoren ermöglichen, im ETO-Anteil. Folglich ist RUNX1-ETO in der Lage, an RUNX1-Zielgene zu binden und deren Regulation über die Rekrutierung von Cofaktoren zu beeinflussen. Hierbei kann RUNX1-ETO sowohl aktivierend als auch reprimierend auf die Genexpression wirken. In der vorliegenden Arbeit konnte in unterschiedlichen Zelllinien bzw. hCD34+ Zellen mittels Überexpressions- bzw. Knockdown-Experimenten der Zusammenhang zwischen der miR-451 Expression und der erythroiden Differenzierung aufgezeigt werden. Es besteht sowohl eine direkte Interaktion von Tal1 und GATA1 mit dem regulatorischen Bereich (Enhancer) des miR-451 Lokus, als auch eine gezielte Aktivierung der miR-451 Expression bei Anwesenheit dieser essentiellen hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren. Eine induzierte Überexpression der miR-451 in hCD34+ Zellen führte sowohl zur Ausbildung erythroider Kolonien als auch zur verstärkten Expression erythroider Oberflächenmarkergene, wie z.B. CD71 und GYPA. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass RUNX1 ebenfalls den Lokus der miR-451 reguliert. Die Bindung von RUNX1 im Promotorbereich des Lokus resultiert in einer verminderten Expression der miR-451 sowie erythroider Differenzierungsgene, während megakaryozytäre Gene, wie z.B. CD41 verstärkt exprimiert werden. Die Anwesenheit dieser Transkriptionsfaktoren im Bereich des Enhancers bzw. Promotors wurde in verschiedenen Zelllinien bzw. hämatopoetischen Stammzellen ebenfalls während der erythroiden bzw. megakaryozytären Differenzierung untersucht. Ihre Bindung im miR-451 Lokus verstärkte sich jeweils, sodass in erythroiden Zellen vermehrt GATA1 sowie Tal1 Bindung im Bereich des Enhancers festgestellt wurde während die Induktion der megakaryozytären Differenzierung zu einer verminderten Okkupation durch Tal1 und GATA1 führte, jedoch zu einer signifikant gesteigerten Präsenz von RUNX1 im Promotorbereich. Die Tatsache, dass RUNX1-Bindemotive im Promotorbereich des miR-451 Clusters vorhanden sind und diese microRNA ein scheinbar wichtiger Faktor während der erythroiden Differenzierung ist, führte im zweiten Teil dieser Arbeit zu Untersuchungen, ob das leukämischen Fusionsproteins RUNX-ETO die Expression der miR-451 beeinflusst. RUNX1-ETO entsteht durch chromosomale Aberrationen, die während der Ausprägung von akuter myeloischer Leukämie (AML) auftreten können. AML ist eine maligne Erkrankung, bei der die Myelopoese und damit ebenfalls die Bildung von Erythrozyten gestört ist, sodass sich unreife Vorläuferzellen im Blut anreichern. In dieser Arbeit konnte aufgezeigt werden, dass RUNX1-ETO im Allgemeinen die Expression erythroider Gene und damit direkt die erythroide Differenzierung reprimiert. Außerdem konnte eine direkte Interaktion von RUNX-ETO mit dem Promotorbereich des miR-451 Lokus nachgewiesen werden. Die Expression des leukämischen Fusionsproteins resultierte des Weiteren in einer reduzierten Okkupation des Lokus durch GATA1 und damit ebenfalls verminderten miR-451 Expression. Somit konnte mit der vorliegenden Arbeit ein weiterer Aspekt geklärt werden, wie das leukämische Fusionsprotein RUNX1-ETO die hämatopoetische Differenzierung negativ beeinflusst, sodass eine Akkumulation unreifer myeloider Vorläuferzellen im Blut sowie Knochenmark auftritt.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Hematopoiesis describes the process of blood cell formation originating from hematopoietic stem cells (HSCs). HSCs produce multipotent progenitor cells, which can differentiate into oligopotent myeloid or lymphoid precursor cells, depending on the development. Finally, further development and differentiation steps result in differentiated, mature blood cells, e.g. erythrocytes or B cells. The regulation of hematopoietic differentiation is subject to a variety of different mechanisms and factors. In addition to cytokines, transcription factors influence the regulation of the individual differentiation processes in a precisely coordinated and highly complex network. Tal1 and RUNX1 belong to the essential hematopoietic transcription factors and are of great importance for the differentiation of HSCs into erythrocytes and megakaryocytes of great importance. Furthermore, microRNAs are involved in many hematopoietic regulatory processes. They control self-renewal of HSCs as well as their differentiation into mature blood cells. MicroRNAs can be regulated by transcription factors and vice versa. Thus, the expression of the microRNA miR-451, which is located together with miR-144 in a cluster, is specifically induced by the erythroid transcription factor GATA-1 during erythroid differentiation. In turn, the presence of miR-451 is essential for terminal erythropoiesis. In addition, studies have shown that the expression of miR-451 is deregulated in various malignancies and may therefore be relevant as a diagnostic biomarker. During leukemogenesis, these essential components of the regulatory network are often targets of genetic modifications. Among others, these modifications can lead to an aberrant expression of a factor or even to the formation of leukemic fusion proteins. Thus, the chromosomal translocation t(8;21)(q22;q22) results in the expression of leukemic fusion protein RUNX1-ETO. RUNX1-ETO can be detected in 12% of all acute myeloid leukemia cases and consists of the N-terminal sequence of RUNX1 and nearly the entire ETO sequence at the C-terminus. Thus, RUNX1-ETO combines the DNA binding motif of RUNX1 (RHD domain) with the NHR domains, which i.a. allow interaction with co-repressors within the ETO's part. Consequently, RUNX1-ETO is able to bind to RUNX1 target genes and influence the regulation via the recruitment of cofactors. RUNX1-ETO can be both activating and repressive for gene expression. In the present work, the correlation between miR-451 expression and erythroid differentiation could be demonstrated in various cell lines and hCD34+ cells by overexpression and knockdown experiments. Tal1 and GATA1 directly bind to the regulatory enhancer region of the miR-451 locus and activate miR-451 expression. Induced overexpression of miR-451 in hCD34+ cells resulted in both the formation of erythroid colonies and the increased expression of erythroid surface marker genes, e.g. CD71 and GYPA. In addition, it could be demonstrated that RUNX1 also regulates the miR-451 locus. The binding of RUNX1 in the promoter region of the locus resulted in a decreased expression of the miR-451 as well as erythroid differentiation genes, while megakaryocytic genes, e.g. CD41, were highly expressed. The presence of these transcription factors in the region of the enhancer or promoter were also investigated in different cell lines and hematopoietic stem cells during erythroid or megakaryocytic differentiation. In erythroid cells, increased binding of GATA1 and Tal1 in the enhancer region of the miR-451 locus was detected, while the induction of megakaryocytic differentiation led to a reduced occupation by Tal1 and GATA1, but to a significantly increased presence of RUNX1 in the promoter region. Due to the reason, that RUNX1 binding motifs are present within the promoter region of the miR-451 cluster and that this microRNA is an important factor during erythroid differentiation, in the second part of this work investigation if the leukemic fusion protein RUNX-ETO influences the miR-451 expression was performed. RUNX1-ETO is caused by chromosomal aberrations, which can occur during acute myeloid leukemia (AML) development. AML is a malignant disease in which myelopoiesis and thus the formation of erythrocytes is disturbed. Therefore, immature progenitor cells accumulate within the blood. In this work, it could be demonstrated that RUNX1-ETO generally represses the expression of erythroid genes and thus directly erythroid differentiation. In addition, a direct interaction of RUNX-ETO with the promoter region of the miR-451 locus could be detected. The expression of the leukemic fusion protein further resulted in a reduced occupation of the locus by GATA1 and in a reduced miR-451 expression. Consequently, the present study clarified another aspect of how the leukemic fusion protein RUNX1-ETO negatively influences the hematopoietic differentiation, which results in an accumulation of immature myeloid progenitor cells within the blood and bone marrow.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 10 Department of Biology > Stem Cell and Developmental Biology
10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 19 Dec 2019 15:31
Last Modified: 09 Jul 2020 02:54
DOI: 10.25534/tuprints-00009465
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-94656
Referees: Süss, Prof. Dr. Beatrix and Lausen, Prof. Dr. Jörn
Refereed: 8 November 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/9465
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